高效液相色譜法測(cè)定酵母粉腺嘌呤含量

劉國生，黃 倩，王玉娟，紀(jì)龍翔，王秀強(qiáng)

(1.河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007;2.新鄉(xiāng)拓新生化科技有限公司，河南 新鄉(xiāng)453000)

高效液相色譜法測(cè)定酵母粉腺嘌呤含量

劉國生1，黃 倩1，王玉娟1，紀(jì)龍翔1，王秀強(qiáng)2

(1.河南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453007;2.新鄉(xiāng)拓新生化科技有限公司，河南 新鄉(xiāng)453000)

目的 建立高效液相色譜法測(cè)定酵母粉腺嘌呤的含量，為酵母粉質(zhì)量評(píng)價(jià)奠定方法學(xué)基礎(chǔ)。方法 將酵母粉經(jīng)過破壁處理后用高氯酸消解制備提取液，通過條件實(shí)驗(yàn)確定高效液相色譜法分離條件并測(cè)定腺嘌呤含量。結(jié)果 采用Diamonsil C18柱，以0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.0)為流動(dòng)相，流速為0.8 mL/min，可以將腺嘌呤與其它成分有效分離。采用121℃高溫高壓-SDS法進(jìn)行酵母粉前處理能有效破壁和促進(jìn)核酸物質(zhì)的釋放，腺嘌呤測(cè)定值更接近其實(shí)際含量。結(jié)論 采用高溫高壓-SDS法制備酵母粉提取液、高效液相色譜測(cè)定腺嘌呤含量的方法簡(jiǎn)單易行、重現(xiàn)性好，測(cè)定結(jié)果可作為酵母粉質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要定量指標(biāo)，對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)有重要指導(dǎo)意義。

腺嘌呤;酵母粉;肌苷發(fā)酵;高效液相色譜法

肌苷發(fā)酵屬于代謝控制發(fā)酵，生產(chǎn)所用的菌株是腺嘌呤缺陷型菌株，需在發(fā)酵原料中提供適宜濃度的腺嘌呤［1-3］。目前國內(nèi)均利用天然培養(yǎng)基進(jìn)行的肌苷發(fā)酵生產(chǎn)，腺嘌呤主要來自于酵母粉。肌苷產(chǎn)量很容易受到酵母粉原料質(zhì)量的制約。不同廠家生產(chǎn)的酵母粉原料，其腺嘌呤含量有很大差別，甚至同一廠家不同批次的產(chǎn)品也會(huì)因生產(chǎn)季節(jié)、原料等變化而出現(xiàn)波動(dòng)，從而影響肌苷發(fā)酵的產(chǎn)量［1］，造成生產(chǎn)不穩(wěn)定。目前企業(yè)對(duì)酵母粉質(zhì)量的檢測(cè)主要是測(cè)定蛋白含量、灰分及酵母形態(tài)等指標(biāo)［4-5］，這些指標(biāo)雖然對(duì)于發(fā)酵生產(chǎn)有一定的意義，但尚無法滿足精確、及時(shí)調(diào)整原料用量以指導(dǎo)生產(chǎn)。影響測(cè)定腺嘌呤含量的關(guān)鍵性因素包括細(xì)胞破壁、大分子消解、抽提以及色譜條件等 。本文在優(yōu)化上述各條件的基礎(chǔ)上，建立快速準(zhǔn)確的酵母粉腺呤含量測(cè)定方法，為肌苷發(fā)酵生產(chǎn)中酵母粉質(zhì)量評(píng)價(jià)奠定方法學(xué)基礎(chǔ)。

1材料

酵母粉，新鄉(xiāng)拓新生化科技有限公司提供;腺嘌呤(含量≥98%)、溶菌酶、蝸牛酶，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;甲醇為色譜純;其他試劑均為分析純。

LC-10A高效液相色譜儀(包括SPD-10AV檢測(cè)器)，島津公司;BS110型電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 高效液相色譜條件

色譜柱為 Diamonsil C18柱(200 mm ×4.6 mm，5 μm)，檢測(cè)波長(zhǎng) 254 nm，進(jìn)樣量 20 μL。以 0.02 mol/L磷酸二氫鉀緩沖液為流動(dòng)相，用稀磷酸調(diào)節(jié)pH 3.0 ～7.8，流速 0.5 ～1.2 mL/min，考察不同條件下腺嘌呤與其它成分的分離效果。結(jié)果表明，在pH 6.0，流速為0.8mL/min條件下腺嘌呤峰與其它成分分離好、峰形對(duì)稱(圖1)。

圖1 腺嘌呤對(duì)照品(A)和酵母粉提取液(B)高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of Adenine standard(A)and extract of yeast powder(B)

2.2 腺嘌呤標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取腺嘌呤對(duì)照品25 mg，置1 000 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.25μm微孔濾膜過濾，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。取對(duì)照品儲(chǔ)備液稀釋配制成濃度分別為5，10，15，20和25 mg/L的腺嘌呤標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣20μL測(cè)定。將峰面積(A)對(duì)濃度(C)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程:C=2×10－5A －0.321 7，r=0.999 2。結(jié)果表明腺嘌呤在上述濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 酵母粉提取液的制備及腺嘌呤含量測(cè)定

要準(zhǔn)確測(cè)定酵母粉中腺嘌呤含量，關(guān)鍵在于細(xì)胞的破碎和核酸類物質(zhì)的充分釋放，因此不同的前處理方法將會(huì)影響測(cè)定結(jié)果的真實(shí)性。本實(shí)驗(yàn)為了考察SDS、溶菌酶、蝸牛酶、機(jī)械研磨、高溫處理等不同因素對(duì)細(xì)胞破碎及腺嘌呤測(cè)定的影響，在綜合其它腺嘌呤測(cè)定方法［8-13］的基礎(chǔ)上，分別采用表1中的6種不同的前處理方法處理酵母粉懸液，處理后用HClO42 mL進(jìn)行消解，調(diào)pH 6.0，加磷酸二氫鉀緩沖液至10 mL，濾過得酵母粉提取液。提取液經(jīng)過離心、0.25μm微孔濾膜過濾后進(jìn)行液相色譜分析測(cè)定腺嘌呤含量(以酵母粉中腺嘌呤含量表示)，結(jié)果見表1。

由表1可見，不同的前處理方法確實(shí)對(duì)測(cè)定結(jié)果有較大的影響。其中沸水浴-SDS、研磨-SDS法與SDS破壁法得到的結(jié)果相近，其中沸水浴-SDS法測(cè)定的腺嘌呤含量有所提高，說明高溫處理有助于酵母細(xì)胞的破壁和測(cè)定目標(biāo)物的釋放;而研磨-SDS法測(cè)定數(shù)據(jù)有所降低，離心時(shí)發(fā)現(xiàn)處理液黏度增加、固形物分離難度增加。經(jīng)蝸牛酶-SDS破壁、溶菌酶-SDS破壁前處理提到的提取液其測(cè)定結(jié)果顯著高于前面3種方法，其中溶菌酶的效果優(yōu)于蝸牛酶，表明酶處理有助于細(xì)胞破壁和內(nèi)容物釋放。因此酶-SDS處理法制備提取液測(cè)定嘌呤含量是比傳統(tǒng)的SDS法更接近實(shí)際值。

在前處理實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，沸水浴處理有助于堿基類物質(zhì)的釋放，因此在SDS處理前進(jìn)行121℃高溫高壓處理，結(jié)果意外發(fā)現(xiàn)該法制備的提取液測(cè)定結(jié)果顯著高于前面5種方法，且重現(xiàn)性好。測(cè)定數(shù)值的提高說明核酸等細(xì)胞內(nèi)容物釋放更充分、消解更徹底。其原因可能是通過高溫高壓細(xì)胞內(nèi)蛋白等物質(zhì)由于變性絮凝度增加，而含有嘌呤的核酸類物質(zhì)與固形物更容易實(shí)現(xiàn)分離和被徹底消解并以堿基形式釋放出來，因此測(cè)定值更能接近樣品中腺嘌呤的實(shí)際含量。因此121℃高溫高壓-SDS法是一種比酶-SDS、研磨-SDS更有效的制備酵母提取液、測(cè)定腺嘌呤以及其它堿基含量的簡(jiǎn)單有效方法。在本文后續(xù)實(shí)驗(yàn)中采用此種方法進(jìn)行酵母粉提取液制備和腺嘌呤含量測(cè)定。

2.4 高溫高壓-SDS法制備提取液測(cè)定腺嘌呤含量的重現(xiàn)性

用高溫高壓-SDS破壁對(duì)酵母粉進(jìn)行前處理制備提取液，并測(cè)定腺嘌呤含量，進(jìn)行了6次重復(fù)試驗(yàn)，換算為酵母粉中腺嘌呤含量，結(jié)果分別為7.48，7.66，7.70，7.61，7.68 和 7.59 mg/g，平 均7.62 mg/g，RSD 為1.0%，表明重現(xiàn)性良好。

2.5 回收率試驗(yàn)

表1 酵母粉不同前處理方法及其提取液腺嘌呤含量(n=3，x±s)Tab.1 Pre-treatingmethods for yeast powder and adenine content of extracts(n=3，x±s)

取已知腺嘌呤含量的酵母粉樣品，分別加入一定量腺嘌呤對(duì)照品，用高溫高壓-SDS破壁法進(jìn)行前處理制備提取液，并測(cè)定腺嘌呤含量，計(jì)算其回收率，結(jié)果見表2，平均回收率為 93.32%，RSD為2.4%。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of recovery experiments

2.6 不同來源的酵母粉腺嘌呤含量測(cè)定及與發(fā)酵產(chǎn)肌苷的關(guān)系

不同來源的酵母粉外觀顏色、味道會(huì)有所不同，顯微檢驗(yàn)觀察細(xì)胞形態(tài)、大小也有較大的差別，通過長(zhǎng)期實(shí)踐人們也積累了一定的經(jīng)驗(yàn)，比如具有典型的酵母香味、細(xì)胞形態(tài)較小且均勻的酵母粉通常發(fā)酵肌苷產(chǎn)量也較高。但這些尚不能對(duì)酵母粉質(zhì)量進(jìn)行較為準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)生產(chǎn)過程中使用的不同來源的酵母粉用高溫高壓-SDS破壁法進(jìn)行前處理制備提取液，并測(cè)定腺嘌呤含量，結(jié)果見表3，并跟蹤這些酵母粉發(fā)酵生產(chǎn)肌苷的產(chǎn)量，從而為酵母粉質(zhì)量提供評(píng)價(jià)依據(jù)。結(jié)果表明，不同廠家來源的酵母粉腺嘌呤含量有較大差異，同一廠家不同批次也有波動(dòng)。一般能夠滿足肌苷發(fā)酵生產(chǎn)用的酵母粉的腺嘌呤含量在8～9 mg/g，含量高者肌苷產(chǎn)量也高，當(dāng)腺嘌呤含量低于7 mg/g時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)苷能力顯著下降，不能用于生產(chǎn)。

表3 不同來源的酵母粉Ade含量及其發(fā)酵產(chǎn)肌苷產(chǎn)量Tab.3 The content of adenine in different yeast powder and their fermentation of inosine

3 討論

采用 Diamonsil C18色譜 柱(200 mm ×4.6mm，5 μm)、0.02 mol/L磷酸二氫鉀緩沖液為流動(dòng)相對(duì)酵母粉提取液進(jìn)行腺嘌呤含量測(cè)定，條件試驗(yàn)表明流動(dòng)相pH 6.0、流速0.8 mL/min時(shí)腺嘌呤峰分離良好。6種酵母粉前處理方法實(shí)驗(yàn)表明，采用121℃高溫高壓-SDS破壁處理是最為簡(jiǎn)單有效的方法，通過高溫高壓處理，細(xì)胞容易破壁、核酸類物質(zhì)易于與其它固形物分離通過消解釋放出堿基類物質(zhì)，因此測(cè)定結(jié)果最接近樣品中腺嘌呤的實(shí)際含量。通過高溫高壓-SDS前處理方法制備提取液，用高效液相色譜法測(cè)定其含量，結(jié)果可靠，重復(fù)性好，回收率高。用此法測(cè)定酵母粉腺嘌呤含量數(shù)據(jù)可以作為肌苷發(fā)酵生產(chǎn)中評(píng)價(jià)分析酵母粉質(zhì)量的一個(gè)重要指標(biāo)，從而更好地指導(dǎo)肌苷發(fā)酵生產(chǎn)。

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Determ ination of adenine content in yeast powder by HPLC

Purpose To establish amethod for the determination of adenine content in yeast powder by HPLC and to lay amethodology basis for the quality assessment of yeast powder.M ethods After the yeast powder was pre-treated by way of wall-breaking，degraded with perchloric acid，the extracts were prepared for the sepration and determination of adenine by HPLC.Results Under the following conditions:Diamonsil C18column，pH 6.0，0.02 mol/L phosphate buffer asmobile phase and flow rate 0.8 mL/min，adenine could be separated effectively from other components.The yeast powder pre-treatment experiments showed that yeast cell wall could be effectively broken through 121℃autoclaving-SDS pretreatment and nucleic acid was promoted to release，and the determination results of adenine were closer to the natural value.Conclusion Themethod using autoclaving-SDS to prepare yeast powder extracts and determining the adenine content by HPLC，is simple and reproducible.Analysing resultswould be an important evaluation index to investigate yeast powder quantitatively，which is of significance for guiding the production of inosine fermentation.

adenine;yeast powder;inosine fermentation;HPLC

TQ460.72

:A

:1005-1678(2012)05-0552-03

2011-09-10

國家科技部科技人員服務(wù)企業(yè)行動(dòng)項(xiàng)目(2009GJD00044);河南省教育廳自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2011B180032)

劉國生，男，博士，教授，從事工業(yè)微生物研究，Tel:15937310368，E-mail:hnliugs@163.com。

LIU Guo-sheng1，HUANG Qian1，WANG Yu-juan1，JILong-xiang1，WANG Xiu-qiang2

(1.School of Life Sciences，Henan Normal University，Xinxiang 453007，China;2.Xinxiang Tuoxin Biochemical and Technology ＆ Science Co.，Ltd.，Xinxiang 453000，China)