六株乳桿菌胃腸道定植能力分析

郝 冉，羅學(xué)剛，賈 瑋，李 方，張同存，2

(1.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部及天津市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457;2.武漢科技大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430065)

六株乳桿菌胃腸道定植能力分析

郝 冉1，羅學(xué)剛1，賈 瑋1，李 方1，張同存1，2

(1.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部及天津市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457;2.武漢科技大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430065)

目的 分析確定Lactobacillus Acidophilus(L.acidophilus)1.1等六株乳桿菌胃腸道定植能力強(qiáng)弱。方法通過模擬人體胃酸環(huán)境(pH 3)和高膽鹽環(huán)境(膽鹽含量:0.1% ～0.3%)，及用膠原蛋白和人結(jié)腸癌細(xì)胞SW-480模擬人腸道黏附環(huán)境，利用MTT法分別測(cè)定六株乳桿菌在酸性和高膽鹽環(huán)境下37℃作用4 h后的存活菌率及與黏附介質(zhì)作用1 h后的黏附率。結(jié)果 六株乳桿菌均具有一定的耐酸和耐膽鹽能力，以及不同程度的膠原蛋白及腸道細(xì)胞黏附能力，其中以L.acidophilus1.2相對(duì)最為突出。結(jié)論 L.acidophilus 1.2等六株乳桿菌均能夠不同程度的黏附定植在胃腸道中，發(fā)揮其益生作用，是較為理想的胃腸道微生態(tài)制劑候選菌株。

乳桿菌;耐酸;耐膽鹽;黏附;定植

乳酸菌在人體胃腸道內(nèi)的定植能力和存活能力的高低將直接關(guān)系到其益生作用的發(fā)揮。乳酸菌能否在人體內(nèi)定植存活主要與其耐酸耐膽鹽能力和腸道黏附能力有關(guān)［1］。本研究通過模擬人體胃酸環(huán)境及腸道高膽鹽環(huán)境，測(cè)定了六株乳桿菌的耐酸、耐膽鹽能力;同時(shí)用膠原蛋白和人結(jié)腸癌細(xì)胞SW-480模擬人腸道黏附環(huán)境，測(cè)定了不同乳酸菌對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)及腸道細(xì)胞黏附能力的差異，為篩選具有較高人體胃腸道存活定植能力的乳酸菌菌株，進(jìn)而開發(fā)相應(yīng)微生態(tài)制劑及功能食品奠定基礎(chǔ)。

1材料

1.1 菌株和細(xì)胞

嗜酸乳桿菌 (Lactobacillus acidophilus，L.acidophilus)1.1、1.2，干酪乳桿菌(L.casei)1.2435、1.539，清酒乳桿菌(L.sake)，植物乳桿菌(L.plantarum)，人結(jié)腸癌細(xì)胞SW-480，均為本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中所保存。

1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基采用常規(guī)方法配制［2］。MRS低pH液體培養(yǎng)基:用0.1 mol/L鹽酸將MRS液體培養(yǎng)基pH調(diào)整到3，115℃高壓滅菌30 min。MRS高膽鹽液體培養(yǎng)基:用豬膽鹽將MRS液體培養(yǎng)基膽鹽含量調(diào)整為1～3 g/kg(0.1% ～0.3%)，115 ℃高壓滅菌30 min。

細(xì)胞培養(yǎng)基:含10%滅活小牛血清的DEME低糖培養(yǎng)基。

1.3 試劑

四甲基偶氮唑鹽(MTT)溶液的配制:MTT 100 mg，加 pH 7.2、0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液(PBS)20 mL，使其充分溶解，用0.22μm微孔過濾器除菌，分裝于1.5 mL的EP管中，4℃避光保存并在兩周內(nèi)使用。

2方法

2.1 菌株培養(yǎng)

冷藏菌株接入MRS液體培養(yǎng)基，37℃厭氧條件下活化轉(zhuǎn)接三次，復(fù)蘇菌液再轉(zhuǎn)入MRS液體培養(yǎng)基，37℃厭氧條件下培養(yǎng)至活菌量約為109cfu/mL。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將SW480細(xì)胞置于含10%熱滅活的新生牛血清和雙抗(青霉素、鏈霉素濃度各為100 u/mL)的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，每2 d換一次培養(yǎng)液，4 d傳代一次。將細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板待長至單層細(xì)胞后進(jìn)行黏附實(shí)驗(yàn)。

2.3 耐酸能力測(cè)定

菌株于MRS液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜(15 h)，離心收集菌體重懸于pH為3.0的液體MRS培養(yǎng)基中，調(diào)整濃度為5×108cfu/mL。取菌液100μL于96孔板中，每個(gè)樣液做3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)以常規(guī)pH值MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)組作為陰性對(duì)照。置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，后每孔加入MTT溶液20μL，作用4 h后終止培養(yǎng)。每孔加入二甲亞砜(DMSO)100 μL，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)量570 nm波長處的吸光度(A)值，存活率 =(A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組)×100%。

2.4 耐膽鹽能力測(cè)定

菌株于MRS液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜(15 h)，離心收集菌體重懸于含0.1% ～0.3%膽鹽的液體MRS培養(yǎng)基中，調(diào)整濃度為5×108cfu/mL，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。采用2.3項(xiàng)下方法測(cè)定存活率。

2.5 膠原蛋白黏附能力測(cè)定

從大鼠尾腱中提取鼠尾膠原，鋪于96孔板至干燥。分別將六株乳桿菌(5×108cfu/mL)100μL加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h后，用滅菌的PBS漂洗3次，以洗去未黏附的菌。應(yīng)用MTT法分別測(cè)定PBS漂洗后的乳桿菌、未漂洗的乳桿菌及未加菌空白對(duì)照孔的A值，黏附率=(A黏附菌－A對(duì)照)/(A總菌－A對(duì)照)×100%。

2.6 結(jié)腸細(xì)胞黏附能力測(cè)定

將已長至單層的SW480人結(jié)腸細(xì)胞用滅菌的PBS(pH 7.4)漂洗2次，分別將六株乳桿菌(5×108cfu/mL)100μL加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，采用2.5項(xiàng)下方法測(cè)定黏附率。

3 結(jié)果

3.1 耐酸能力

胃液pH值為3.0左右，食品通過胃的時(shí)間相對(duì)較短，一般為1～2 h，所以菌株應(yīng)能夠耐受胃酸，可以通過胃進(jìn)入腸道，并符合活菌數(shù)達(dá)到106cfu/mL的要求［3］。為觀察菌株在更長時(shí)間下的耐受能力，本實(shí)驗(yàn)將時(shí)間加倍，觀察乳桿菌在pH為3.0的液體MRS培養(yǎng)基中4 h后的存活率。結(jié)果如圖1所示。六株菌株均具有較強(qiáng)的抗酸能力，能順利經(jīng)由胃到達(dá)腸道。其中L.acidophilus的耐酸能力顯著強(qiáng)于其它菌種，L.acidophilus 1.1、1.2 在 pH 為 3.0的條件下培養(yǎng)4 h后存活率為分別為15.09%和18.75%;L.sake耐酸能力最差，存活率僅為0.85%。本實(shí)驗(yàn)初始菌含量約為5×108cfu/mL，在pH 3.0的條件下，4 h后五種乳桿菌活菌數(shù)仍能達(dá)到107cfu/mL，而耐酸性最差的L.sake也能達(dá)到106cfu/mL以上。

3.2 耐膽鹽能力

圖1 六株乳桿菌耐酸能力分析Fig.1 Determination of the difference of acid resistantability of Lactobacillus

人體小腸中膽汁鹽含量在0.03% ～0.3%之間波動(dòng)，食物通過腸道的時(shí)間約2～3 h［4］。本實(shí)驗(yàn)用含0.1%，0.2%，0.3% 膽鹽的液體 MRS 培養(yǎng)基將六株乳酸菌濃度調(diào)整為5×108cfu/mL，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，觀察菌株在4 h后活菌的變化情況。由圖2可見，六株乳酸菌在含0.1% ～0.3%膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h后的菌存活率差異顯著。L.plantarum耐膽鹽能力最強(qiáng)，在含有0.1%膽鹽的MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h后，活菌數(shù)不但沒有下降，反而有上升的趨勢(shì)。在含0.2%和0.3%膽鹽的MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h后存活率也依然分別維持在72.24%和50.43%。L.sake耐膽鹽能力最差，在含0.3%膽鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h后存活率僅為5.51%。但六株乳桿菌在含0.3%膽鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h后活菌數(shù)均超過106cfu/mL，有的甚至可超過107cfu/mL。由此表明，在小腸正常膽汁鹽條件下，六株乳酸菌均具有較強(qiáng)的抗膽汁鹽能力，能順利通過小腸到達(dá)大腸。

圖2 六株乳桿菌耐膽鹽能力分析Fig.2 Determination of the difference ofbile sale resistantability of Lactobacillus

3.3 對(duì)膠原蛋白的黏附能力

膠原蛋白是一種重要的細(xì)胞外基質(zhì)，對(duì)于乳酸菌的腸道黏附定植具有重要的作用。本研究提取鼠尾膠原鋪于96孔板，模擬腸道黏附環(huán)境，MTT法分析不同乳酸菌對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)黏附能力的差異。結(jié)果見圖3，這六株乳酸菌與膠原蛋白均有不同程度的黏附能力，黏附菌數(shù)均達(dá)到107cfu/mL以上，其中以L.acidophilus 1.2的黏附能力最強(qiáng)，黏附率達(dá)到37.87%，L.plantarum 黏附能力最差，只有5.23%。

3.4 對(duì)腸道細(xì)胞的黏附能力

圖3 六株乳桿菌對(duì)膠原蛋白的黏附能力分析Fig.3 Determination of the difference of adhesive ability of Lactobacillus to collagen

乳酸菌在腸道的黏附定植部位主要發(fā)生在結(jié)腸［5］，因此本研究采用人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480模擬腸道環(huán)境，通過MTT法測(cè)定不同乳酸菌對(duì)結(jié)腸細(xì)胞黏附能力的差異。結(jié)果如圖4，與膠原蛋白黏附能力結(jié)果一致，這六株乳酸菌與結(jié)腸癌細(xì)胞黏附能力存在較為明顯的差異，但黏附菌數(shù)均達(dá)到107cfu/mL以上，其中以L.acidophilus 1.2的黏附能力最強(qiáng)，黏附率達(dá)到62.19%，L.plantarum黏附能力最差，只有11.36%。

圖4 六株乳桿菌對(duì)結(jié)腸細(xì)胞的黏附能力分析Fig.4 Determination of the difference of adhesive ability of Lactobacillus to human colon cells

4 討論

人類的胃腸道含有1 000多種、約1013～1014個(gè)微生物，它們?cè)谌梭w胃腸道中定植并進(jìn)行繁殖，構(gòu)成了一個(gè)復(fù)雜的微生態(tài)環(huán)境［6-7］。大量研究證明，進(jìn)入并定植于人類胃腸道的乳酸菌可以作為正常的微生物菌群成員而存在，它與宿主的共生對(duì)宿主具有很多益生作用，包括維持腸道的微生態(tài)平衡、增強(qiáng)機(jī)體的免疫機(jī)能、預(yù)防和抑制腫瘤的發(fā)生、改善肝臟功能、改善血脂平衡、增強(qiáng)免疫功能等［8］。隨著微生態(tài)理論研究的不斷加深，基于益生菌的微生態(tài)制劑的開發(fā)應(yīng)用也日趨活躍。微生態(tài)制劑具有其他藥物不可替代的優(yōu)點(diǎn)，即“患病治病，未病防病，無病保健”的效果［9］。

據(jù)報(bào)道［10-11］，只有攝入106cfu/mL以上的活性乳桿菌才能充分發(fā)揮其益生功效。胃酸和膽鹽具有較強(qiáng)的抗菌作用，乳桿菌被食入后必須要通過惡劣的胃液并抵抗來自膽汁的膽鹽、順利抵達(dá)結(jié)腸進(jìn)行黏附定植后，方可有效的發(fā)揮其益生作用。因此耐酸耐膽鹽生長能力及黏附能力是乳桿菌作為益生菌篩選重要指標(biāo)之一。各乳酸菌株間對(duì)胃酸和膽鹽的耐受性有很大差異，pH 3、膽鹽0.3%是衡量菌株耐受人體胃腸道的標(biāo)準(zhǔn)。在本研究中，耐酸與耐膽鹽實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，L.acidophilus1.1、L.acidophilus 1.2、L.casei 1.2435、L.casei 1.539、L.sake、L.plantarum活菌數(shù)均能保持在106cfu/mL以上，且與膠原蛋白及結(jié)腸細(xì)胞的黏附菌數(shù)均可達(dá)到107cfu/mL以上，表明這六株菌均具有較強(qiáng)的黏附能力，能夠有效的黏附定植在胃腸道中，發(fā)揮其益生作用，其中特別是L.acidophilus1.2具有非常好的胃腸道存活及定植能力。

此外，MTT可被活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶將其四唑環(huán)還原為難溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物甲臜(Fonmazan)，而死細(xì)胞無此作用。因此通過用DMSO溶解所生成的甲臜，測(cè)定在一定波長下的光吸收值即可間接反映活細(xì)胞數(shù)量［12］。本研究采用的MTT快速活菌計(jì)數(shù)法，較平板計(jì)數(shù)法具有工作量小、操作簡單快速、重復(fù)性好、能區(qū)分死活菌等有點(diǎn)，可很好的應(yīng)用于涉及到活菌計(jì)數(shù)等分析研究中。

總之，在模擬胃腸環(huán)境條件下，本研究所用的六株乳桿菌可以順利通過胃腸高酸、高膽汁鹽環(huán)境，并在腸道實(shí)現(xiàn)黏附定植與正常繁殖，從而發(fā)揮其健康促進(jìn)作用，其中以L.acidophilus1.2相對(duì)最為突出。該研究為胃腸道微生態(tài)制劑和功能食品開發(fā)奠定了很好的基礎(chǔ)。

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Study on the colonization ability of six strains of Lactobacillus in gastrointestinal tract

HAO Ran1，LUO Xue-gang1，JIAWei1，LIFang1，ZHANG Tong-cun1，2
(1.Key Laboratory of Industrial Microbiology，Ministry of Education and Tianjin City，School of Bioengineering，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China;
2.School of Medicine，Wuhan University of Science and Technology，Wuhan 430065，China)

Purpose To study the colonization ability of 6 strains of Lactobacillus in gastrointestinal tract.M ethods Lactobacillus were cultured at37 ℃ for 4 h in MRSbroth with high concentration of acid(pH 3)or bile salt to simulate human gastric or intestinal bile salt condition，respectively，and then the MTT assay was performed to determine the viability of different strains.The collagen and human colon cancer cells SW-480 were used to imitate the human intestinal environment and MTT assay was also be carried out to detect the adhesive ability of Lactobacillus after co-cultured for 1 h.Results All the six strains of Lactobacillus have acid and bile sale resistant ability，aswell as adhesive ability to collagen and human colon cancer cells.Of these strains，Lactobacillus acidophilus 1.2 exhibited the greatest ability to pass the gastrointestinal tractand colonize in the colon.Conclusion Six strains of Lactobacillus，especially the Lactobacillusacidophilus1.2，could adhere and colonize in the gastrointestinal tract，and then facilitate to play their healthcare functions in vivo.They can therefore be used as ideal probiotics candidates of functional food additives or drugs.

Lactobacillus;acid resitant;bile salt resistant;adhesion;colonization

R915

:A

:1005-1678(2012)05-0555-04

2011-09-20

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)資助(NO.2008AA10Z336)

郝 冉，女，在讀碩士研究生，主要從事益生菌微生態(tài)制劑的研究開發(fā);張同存，通信作者，博士生導(dǎo)師，Tel:022-60600518，Email:tony@tust.edu.cn;羅學(xué)剛，碩士生導(dǎo)師，Tel:022-60602099，Email:luoxuegang@tust.edu.cn。