王平 李敏 漆正堂 丁樹哲

1華東師范大學體育與健康學院（上海 200241） 2太原科技大學體育學院 3商丘師范學院體育學院

自噬（autophagy）是細胞在生長、發(fā)育過程中維持穩(wěn)態(tài)的一種機制，是細胞利用溶酶體降解自身受損細胞器和大分子物質的過程，從而維持細胞的穩(wěn)定，是真核細胞特有的生命現(xiàn)象。自噬在進化過程中高度保守，從酵母、果蠅到哺乳動物都能找到與自噬相關的同源基因，這些基因調控細胞器和蛋白質的降解［1］。由于自噬參與物質代謝、氧化損傷、饑餓等應激反應，并且與生物合成過程中原料的循環(huán)利用密切相關，引起研究者極大的興趣。近兩年《Science》報道了多篇關于自噬的研究。近年研究發(fā)現(xiàn)，自噬在機體穩(wěn)定、生物合成、細胞發(fā)育、組織重塑、環(huán)境適應、預防疾病等方面具有十分重要的作用，自噬缺陷或不足與骨骼肌相關疾病、神經退行性變化、衰老和新陳代謝等疾病密切相關［2］。因此，關于運動對自噬的影響，尤其是骨骼肌自噬在運動中的變化引起學者的普遍關注。本文主要介紹骨骼肌自噬及運動影響骨骼肌自噬分子機制，深入探討運動對骨骼肌自噬的影響，進一步闡明運動維持骨骼肌質量、運動防治神經退行性變化等疾病的分子機制，同時為骨骼肌萎縮和衰老的防治策略提出新的觀點。

1 骨骼肌自噬概述

骨骼肌主要由具有收縮能力的肌細胞組成，機體的任何活動和運動都是骨骼肌收縮完成的。骨骼肌收縮過程中，線粒體產生能量，同時也產生活性氧，活性氧對骨骼肌細胞的結構產生有害作用。因此，肌細胞需要一個有效系統(tǒng)移除受損蛋白質、不正常和失去功能的細胞器。自噬系統(tǒng)對上述發(fā)生事件負責，它將部分胞漿、細胞內需要降解的細胞器、蛋白質形成分隔膜包繞，繼而形成自噬體，自噬體通過細胞骨架微管系統(tǒng)運輸至溶酶體，從而降解其內成分，自噬體膜脫落再循環(huán)利用［3］。

1.1 自噬與骨骼肌萎縮

許多因素諸如制動、失重、代謝性疾病等均可導致骨骼肌萎縮［4］。分析其原因主要是蛋白質分解大大超過蛋白質合成。蛋白質分解系統(tǒng)的激活與基因轉錄密切相關。不同學者對不同肌肉萎縮模型進行研究，結果發(fā)現(xiàn)，調控肌肉萎縮的基因是一致的，因此，將它命名為肌肉萎縮基因［5-7］。在這些基因中，有幾個基因屬于自噬-溶酶體系統(tǒng)，其中最重要的兩個自噬基因是LC3和Gabarap，這兩個基因翻譯的蛋白質，在自噬體膜和溶酶體膜發(fā)生融合時進行降解，上調肌肉萎縮基因［8］。Furuno 等［9］在去神經肌肉模型研究中發(fā)現(xiàn)，溶酶體降解有助于蛋白質分解。但由于在肌纖維復雜的結構中，自噬體的監(jiān)測比較困難，因此，這一領域發(fā)展相對緩慢。近年來，由于生化技術和成像技術的迅速發(fā)展，關于萎縮肌肉中自噬體特征的變化研究也有了很大的提高。Mizushima等［10］發(fā)現(xiàn)轉基因鼠表達LC3，LC3與綠色熒光蛋白（GFP）融合。LC3是酵母自噬基因Atg8在哺乳動物中的同源物，它在膜定型和膜發(fā)育過程中具有極其重要的作用［11］。目前，通過GFP陽性斑點技術很容易觀察到骨骼肌肌原纖維水平和肌纖維肌漿中自噬激活過程，形態(tài)學分析證明，自噬系統(tǒng)的激活發(fā)生于骨骼肌快肌纖維。此模型現(xiàn)已被廣泛應用于生理活動和運動條件下不同組織自噬體大小的比較。另一有趣的發(fā)現(xiàn)是，與肝臟、心臟和胰腺細胞的自噬泡相比，快肌的自噬泡最?。?0］，這也是以前對骨骼肌自噬研究受到局限的原因之一。

最近，有些學者利用上述技術已經揭開了自噬與骨骼肌丟失之間的關系。Mammucari等［12］研究發(fā)現(xiàn)，骨骼肌FoxO3過度表達，激活自噬，導致骨骼肌萎縮，但如果通過RNA干涉（RNAi）抑制關鍵基因LC3表達，那么可以在一定程度上預防FoxO3介導的骨骼肌丟失。其他的基因模型也證實了在骨骼肌萎縮過程中自噬的作用。Dobrowolny等［13］對肌萎縮側索硬化SOD1G93A轉基因小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，氧化應激通過激活自噬導致骨骼肌萎縮；同時他們也證實了LC3與骨骼肌萎縮密切相關。其機制可能是神經元一氧化氮合酶（nNOS）從肌細胞膜發(fā)生遷移，在細胞漿與肌營養(yǎng)不良蛋白-糖蛋白組成復合物，肌漿中自由nNOS引起氧化應激，激活FoxO3介導肌萎縮相關基因atrogin1和MuRF1蛋白質合成過程，導致肌萎縮［14］。目前，已從形態(tài)學角度進行了關于維持肌肉質量方面的研究，但我們仍不知這方面的研究對于保持肌肉力量是否有益？關于這方面的研究也是今后防治骨骼肌萎縮的研究重點。

1.2 自噬與骨骼肌質量的維持

迄今為止，幾乎每一種肌病和肌營養(yǎng)不良患者均發(fā)現(xiàn)有自噬體，并且它具有肌肉功能紊亂的特性［15］。但關于自噬是起決定性作用還是參與肌肉退化機制或是肌細胞存活補償機制，目前還不是很清楚。先天性和后天性肌病的典型特點是蛋白質聚集、線粒體功能紊亂、肌漿網發(fā)生膨大，這些現(xiàn)象提示自噬潮已經損傷。Nogalska等［16］報道，肌病患者或自噬特異基因敲除的大鼠，骨骼肌泛素和P62/SQSTM1蛋白均發(fā)生聚集。為了進一步證實自噬的具體作用機制，Masiero等［17］將大鼠 Atg7基因敲除，特異性阻止骨骼肌自噬途徑，預期結果是肌肉質量得以維持，肌肉收縮蛋白含量增加，肌肉力量得到提高。但令他們驚奇的是，研究結果發(fā)現(xiàn)，自噬的抑制并不是有益的，反而促發(fā)肌萎縮甚至肌病。其可能機制是Atg7基因敲除，引起泛素聚集、異常線粒體增多，聚集在肌原纖維之間或肌纖維膜下的膜結構成分增加，這些因素導致氧化應激，激活未折疊蛋白的應答，這些病理性改變導致肌纖維功能退化。 Raben 等［18］和 Nakai等［19］也用基因敲除鼠進行研究，結果與上述研究一致。這提示泛素是自噬溶酶體途徑的靶蛋白，但不能確定的是聚集的泛素是通過蛋白酶體降解還是通過溶酶體降解。最近，Rossi等［20］報道，細胞質唾液酸酶（Neu2）作為自噬溶酶體系統(tǒng)的底物參與骨骼肌萎縮。但吞噬是通過Neu2蛋白含量減少完成還是通過泛素將Neu2選擇性帶到自噬體完成，還不是很清楚。

1.3 骨骼肌自噬的分子機制及信號調控

與其他代謝組織如肝臟相比，骨骼肌自噬具有其特殊性。禁食時，大多數(shù)組織自噬維持時間很短，只能持續(xù)幾小時。相反骨骼肌自噬維持時間可達數(shù)日［10］。長時間自噬的維持需要自噬關鍵蛋白LC3與Gabarap的及時補充，才能使轉錄過程得以控制，使自噬長時間保持。這提示長時間自噬和短時間自噬具有不同信號通路控制。自噬分子機制的抑制劑和激活劑之間的平衡取決于新形成的自噬泡的發(fā)育及其與溶酶體的融合。關于骨骼肌自噬抑制劑的報道較少，首先被報道的是 Runx1。 事實上，Wang 等［21］利用去神經動物模型研究發(fā)現(xiàn)，Runx1介導去神經骨骼肌自噬發(fā)生，維持骨骼肌質量。如果將Runx1基因敲除，將會導致過度自噬，骨骼肌發(fā)生萎縮。關于Runx1介導自噬抑制的機制不是很清楚，但最近Wildey 等［22］報道，Runx1 可能調控 FoxO3 的活性。

骨骼肌自噬另一個抑制劑是磷脂酶Jumpy。Vergne等［23］利用RNAi技術干預Jumpy蛋白合成，結果發(fā)現(xiàn)在C2C12成肌細胞中有自噬體形成，在饑餓細胞中蛋白質分解率明顯增加。其機制可能是Jumpy抑制P13P的合成，抵消了III型磷脂酰肌醇三磷酸激酶（class IIIPI3K）和VPS34的活性，阻止自噬體形成。但關于Jumpy在正常細胞和萎縮細胞中如何調控還不清楚。

除了上述2種骨骼肌自噬抑制劑外，還有一種激酶是蛋白激酶 B（AKT）。 Zhao 等［24］進行骨骼肌細胞培養(yǎng)，結果發(fā)現(xiàn)，饑餓狀態(tài)下，AKT的激活完全抑制自噬體的形成，同時抑制溶酶體依賴蛋白的降解。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是AKT的下游分子，是氨基酸、ATP和激素的感受器，對細胞生長具有重要調節(jié)作用。事實上，肌肉肥大需要mTOR，因為用雷帕霉素（mTOR抑制劑）進行治療，結果發(fā)現(xiàn)其完全阻斷肌肉發(fā)育或肌纖維再生［25］。但在自噬調控中mTOR的作用微不足道，至少在骨骼肌自噬途徑中，它并沒有對AKT產生抑制作用。Zhao等［26］證實，雷帕霉素介導mTOR的抑制作用能夠使不同分型肌纖維蛋白質分解率增加10%；而AKT抑制劑能夠使蛋白質分解率增加50%。更為重要的是，他們進行在體實驗發(fā)現(xiàn)，通過雷帕霉素和RNAi抑制mTOR通路不能引起肌萎縮和自噬體的形成。同時，他們還發(fā)現(xiàn)，骨骼肌mTOR基因敲除，引起的是肌營養(yǎng)不良而不是肌萎縮，并且引起AKT活性極度活躍，AKT活性極度活躍能夠減緩自噬系統(tǒng)mTOR基因敲除的效應［27］。 但 Tassa 等［28］證實骨骼肌自噬系統(tǒng)不是依賴mTOR控制而是依賴VPS34-beclin1控制。而且，mTOR的下游分子S6K1和S6K2的敲除并不影響培養(yǎng)的肌細胞自噬體的形成［29］。因此，禁食時IGF1-AKT通路的抑制一定是通過mTOR非依賴機制激活自噬過程的。

肌萎縮自噬相關基因的上調研究顯示，幾種轉錄因子有助于自噬的調控。Tracy等［30］最近證實FoxO3在骨骼肌自噬調控中是關鍵因子。在細胞培養(yǎng)和在體骨骼肌研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxO3表達充足，激活自噬溶酶體系統(tǒng)，加速蛋白質分解過程。而且?guī)讉€自噬基因包括 LC3、Gabarap、Bnip3、VPS34、Atg12 都受 FoxO3的調控。同時他們也證實Bnip3是FoxO3的下游因子。Bnip3過度表達能夠導致在體骨骼肌自噬，Bnip3基因敲除能夠減弱FoxO3介導的骨骼肌自噬［12］。自噬的FoxO3依賴性調控似乎是長期支持自噬的普通機制。實際上，已經在果蠅幼蟲、哺乳動物心肌細胞、肝細胞和衰老細胞中發(fā)現(xiàn)自噬相關基因的FoxO3依賴性轉錄上調作用。

最近，McClung 等［31］報道，在氧化應激過程中，P38MAPK通路調控自噬相關基因的表達完全獨立于FoxO3通路，但它在肌萎縮中調控自噬的具體下游轉錄因子還不是很清楚。由于最近關于FoxO3與P38MAPK之間的相互作用得出相反的結果，故相關研究以后還會進一步進行。

2 運動對骨骼肌自噬影響的分子機制

近年來，已有少數(shù)關于運動對骨骼肌自噬相關基因表達影響方面的研究。阿霉素是一種有效的抗腫瘤藥，不幸的是，它在治療過程中對骨骼肌產生毒性作用，使骨骼肌發(fā)生萎縮。其機制可能是阿霉素使骨骼肌產生活性氧，引起氧化損傷，同時激活骨骼肌鈣蛋白酶和Caspase-3蛋白水解系統(tǒng)。Smuder等［32］為了證實耐力運動是否可以通過骨骼肌自噬途徑避免阿霉素對骨骼肌的損害作用，進行了大鼠實驗，他們按照常規(guī)劑量給予大鼠阿霉素，結果發(fā)現(xiàn)，大鼠比目魚肌自 噬 相關 基 因 Beclin-1、ATG12、ATG7、LC3、LC3II/LCI比率和組織蛋白酶L的蛋白水平和基因轉錄水平均明顯升高。同時，他們還證實如果在給予阿霉素之前讓大鼠進行耐力運動，耐力運動增強了骨骼肌抗氧化損傷能力，保護了骨骼肌免受阿霉素引起的氧化應激，減弱了阿霉素引起的骨骼肌自噬相關基因表達的增加，提示耐力運動可以保護骨骼肌免受阿霉素引起的自噬的激活。相反，Stephanie等［33］研究結果顯示，耐力運動對衰老大鼠跖肌自噬沒有產生積極效應。因此，關于耐力運動對骨骼肌自噬影響分子機制的研究尚需深入。

最近，Salminen 等［34］研究發(fā)現(xiàn)，大強度運動可引起骨骼肌炎癥、導致骨骼肌纖維發(fā)生壞疽，但在運動后2～3天骨骼肌自噬激活，形成自噬溶酶體（一種自體吞噬泡），將細胞內蛻變、破損、壞死的細胞器和細胞質清除，發(fā)生細胞更新和重建，自噬反應在運動后2～7天期間最明顯，大概2周左右骨骼肌細胞恢復到正常水平，提示自噬活性的增加與骨骼肌細胞成分的分解有關，同時也能為骨骼肌纖維的再生提供有效的成分。Mackenzie等［35］進行抗阻運動訓練，結果發(fā)現(xiàn)，骨骼肌質量和力量明顯增加，究其原因是由于蛋白質合成增加、分解減少和氨基酸吸收增加，并且上述過程均與Vps34有關。Vps34是III型磷脂酰肌醇3磷酸激酶（classIII PI3K）家族中的一個成員。其機制可能是Vps34介導骨骼肌自噬信號途徑，Vps34與自噬基因Beclin-1形成復合物參與自噬體的形成，但其具體作用還不是很清楚，尚需進一步研究。

3 結語

骨骼肌自噬途徑復雜，關于運動影響骨骼肌自噬途徑的分子機制有待進一步研究。到目前為止，科學家已經清楚地認識到自噬途徑信號通路在骨骼肌質量維持方面起著舉足輕重的作用，但是調控自噬信號通路的確切機制還沒有闡述清楚。尤其關于運動性骨骼肌自噬靶蛋白的鑒別、細胞膜如何將細胞外信號轉導到細胞內、如何刺激自噬途徑的發(fā)生、如何刺激自噬相關基因上下游信號分子的生物發(fā)生及其與自噬體溶酶體系統(tǒng)之間的關系等均需進一步研究。

［1］Joshua D，Rabinowitz A，Eileen W.Autophagy and metabolism.Science，2010，3 （330）：1344-1348.

［2］Levine B，Yuan JY.Autophgy in cell death an innocent convict?J Clin Invest，2005，115（10）：2679-2688.

［3］Mizushima N，Levine B，Cuervo A，et al.Autophagy fights disease through cellular self-digestion.Nature，2008，451（7182）：1069-1075.

［4］Lecker SH，Goldberg AL，Mitch WE.Protein degradation by the ubiquitin-proteasome pathway in normal and disease states.J Am Soc Nephrol，2006，17（7）：1807-1819.

［5］Sandri M.Signaling in muscle atrophy and hypertrophy.Physiology（Bethesda），2008，23（7）：160-170.

［6］Sacheck JM，Hyatt JP，Raffaello A，et al.Rapid disuse and denervation atrophy involve transcriptional changes similar to those of muscle wasting during systemic diseases.Faseb J，2007，21（1）：140-155.

［7］Sandri M，Sandri C，Gilbert A，et al.Foxo transcription factors induce the atrophy-related ubiquitinligaseatrogin-1andcause skeletal muscle atrophy.Cell，2004，117 （5）：399-412.

［8］Mammucari C，Schiaffino S，Sandri M.Downstream of AKT：FOXO3 and mTOR in the regulation of autophagy in skeletal muscle.Autophagy，2007，4（4）：524-526.

［9］Furuno K，Goodman MN，Goldberg AL.Role of different proteolytic systems in the degradation of muscle proteins during denervation atrophy.J Biol Chem，1990，25，265（15）：8550-8557.

［10］Mizushima N，Yamamoto A，Matsui M，et al.In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker.Mol Biol Cell，2004，15（3）：1101-1111.

［11］Nakatogawa H，Suzuki K，Kamada Y，et al.Dynamics and diversity in autophagy mechanisms：lessons from yeast.Nat Rev Mol Cell Biol，2009，10（7）：458-467.

［12］Mammucari C，Milan G，Romanello V，et al.FoxO3 controls autophagy in skeletal muscle in vivo.Cell Metab，2007，6（6）：458-471.

［13］Dobrowolny G，Aucello M，Rizzuto E，et al.Skeletal muscle is a primary target of SOD1G93A-mediated toxicity.Cell Metab，2008，8（5）：425-436.

［14］Suzuki N，Motohashi N，Uezumi A，et al.NO productionResultsin suspension-induced muscle atrophy through dislocation of neuronal NOS.J Clin Invest，2007，117（9）：2468-2476.

［15］Malicdan MC，Noguchi S，Nonaka I，et al.Lysosomal myopathies：an excessive build-up in autophagosomes is too much to handle.Neuromuscul Disord，2008，18 （7）：521-529.

［16］Nogalska A，Terracciano C，Agostino DC，etal.p62/SQSTM1 is overexpressed and prominently accumulated in inclusions of sporadic inclusion-body myositis muscle fibers，and can help differentiating it from polymyositis and dermatomyositis.Acta Neuropathol，2009，118 （3）：407-413.

［17］Masiero E，Agatea L，Mammucari C，et al.Autophagy is required to maintain muscle mass.Cell Metab，2009，10（6）：507-515.

［18］Raben N，Hill V，Shea L，et al.Suppression of autophagy in skeletal muscle uncovers the accumulation of ubiquitinated proteins and their potential role in muscle damage in Pompe disease.Hum Mol Genet，2008，17 （24）：3897-3908.

［19］Nakai A，Yamaguchi O，Takeda T，et al.The role of autophagy in cardiomyocytes in the basalstate and in response to hemodynamic stress.Nat Med，2007，13 （5）：619-624.

［20］Rossi S，Stoppani E，Martinet W，et al.The cytosolic sialidase Neu2 is degraded by autophagy during myoblast atrophy.Biochim Biophys Acta，2009，1790（8）：817-828.

［21］Wang X，Blagden C，F(xiàn)an J，et al.Runx1 prevents wasting，myofibrillardisorganization，and autophagy ofskeletal muscle.Genes Dev，2005，19 （14）：1715-1722.

［22］Wildey GM，Howe PH.Runx1 is a co-activator with FOXO3 to mediate transforming growth factor beta （TGFbeta）-induced Bim transcription in hepatic cells.J Biol Chem，2009，24，284（30）：20227-20239.

［23］Vergne I，Roberts E，Elmaoued RA，et al.Control of autophagy initiation by phosphoinositide 3-phosphatase jumpy.Embo J，2009，28（15）：2244-2258.

［24］Zhao J，Brault JJ，Schild A，et al.Coordinate activation of autophagy and the proteasome pathway by FoxO transcription factor.Autophagy，2008，4（3）：378-380.

［25］Pallafacchina G，Calabria E，Serrano AL，et al.A protein kinase B-dependent and rapamycin-sensitive pathway controls skeletal muscle growth but not fiber type specification.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99 （14）：9213-9218.

［26］Zhao J，Brault J，Schild A，et al.FoxO3 coordinately activates protein degradation by the autophagic/lysosomal and proteasomal pathways in atrophying muscle cells.Cell Metab，2007，6（6）：472–483.

［27］Risson V，Mazelin L，Roceri M，et al.Muscle inactivation of mTOR causes metabolic and dystrophin defects leading to severe myopathy.J Cell Biol，2009，187（6）：859-874.

［28］Tassa A，Roux MP，Attaix D，et al.Class III phosphoinositide 3-kinase--Beclin1 complex mediates the amino acid-dependent regulation of autophagy in C2C12 myotubes.Biochem J，2003，376（Pt 3）：577-586.

［29］Mieulet V，Roceri M，Espeillac C，et al.S6 kinase inactivation impairs growth and translational target phosphorylation in muscle cells maintaining proper regulation of protein turnover.Am J Physiol Cell Physiol，2007，293 （2）：C712-C722.

［30］Tracy K，Macleod KF.Regulation of mitochondrial integrity，autophagy and cell survival by BNIP3.Autophagy，2007，3（6）：616-619.

［31］Mcclung JM，Judge AR，Powers SK，et al.p38 MAPK links oxidative stress to autophagy-related gene expression in cachectic muscle wasting.Am J Physiol Cell Physiol，2010，298（3）：C542-549.

［32］Smuder AJ，Kavazis AN，MinK，et al.Exercise protects against doxorubicin-induced markers of autophagy signaling in skeletal muscle.J Appl Physiol，2011，21 （3）：8413-8418.

［33］Wohlgemuth SE，Seo AY，Marzetti E，et al.Skeletal muscle autophagy and apoptosis during aging：effects of calorie restriction and life-long exercise.Exp Gerontol，2010，45（2）：138-148.

［34］Salminen A，Vihko V.Autophagic response to strenuous exercise in mouse skeletalmuscle fibers.Virchows Archiv Cell，1984，45（1）：97-106.

［35］Mackenzie M，Hamilton D，Murray J，et al.mVps34 is activated by an acute bout of resistance exercise.Biochem Soc Trans，2007，35（Pt5）：1314-1316.