李雪雁,張 維,張秀蘭,李 冰
(蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅 蘭州730050)
菊芋(Helianthus tuberosus)是菊科向日葵屬中能形成地下塊莖的栽培種,其塊莖中菊粉含量可占其干質(zhì)量的70%以上,且這種植物適應(yīng)性強(qiáng),產(chǎn)量高,價(jià)格低廉,是一種寶貴的半野生資源,具有極大的開發(fā)利用價(jià)值。菊芋是酒精發(fā)酵的良好糖源,近年來(lái),有關(guān)利用微生物菊粉酶進(jìn)行菊芋酒精發(fā)酵的報(bào)道[1]相繼出現(xiàn),但選育高產(chǎn)酒精菌種直接應(yīng)用于生產(chǎn)仍是人們努力的方向。余響華等[2]以K氏酵母、糖化酵母為親本,采用單親滅活原生質(zhì)體融合技術(shù)進(jìn)行屬間融合,構(gòu)建可直接轉(zhuǎn)化淀粉產(chǎn)酒精的菌株。結(jié)果獲得高于92%的形成率和6.5%的再生率,最終獲得一株性狀穩(wěn)定、酒精轉(zhuǎn)化率高的融合子,在含5.0%的可溶性淀粉發(fā)酵液中,酒精度可達(dá)7.0%。本研究通過(guò)設(shè)定合適的原生質(zhì)體制備與融合條件,使釀酒酵母[3]與一種能高產(chǎn)菊粉酶的青霉菌菌株進(jìn)行原生質(zhì)體融合,通過(guò)測(cè)定融合菌株的產(chǎn)菊粉酶能力和產(chǎn)酒精能力,選用各項(xiàng)性能較優(yōu)的融合子作為利用菊芋進(jìn)行酒精發(fā)酵的菌株,旨為生物質(zhì)可再生資源轉(zhuǎn)化生產(chǎn)燃料酒精提供理論依據(jù)和研究資料。
1.1.1 菌種 釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)為蘭州理工大學(xué)生命學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存;青霉菌(Penicillium)為本試驗(yàn)前期工作中篩選所得產(chǎn)菊粉酶的菌株。
1.1.2 培養(yǎng)基
酵母YPD培養(yǎng)基:蛋白胨10g·L-1,葡萄糖20g·L-1,酵母膏10g·L-1。
青霉菌培養(yǎng)基:菊粉40g·L-1,酵母膏5 g·L-1,(NH4)2HPO410g·L-1。
再生培養(yǎng)基:將15%蔗糖(溶透穩(wěn)定劑)加入YPD培養(yǎng)基,成分參見(jiàn)酵母YPD培養(yǎng)基。
融合子酒精發(fā)酵培養(yǎng)基:菊粉90g·L-1,酵母膏5g·L-1,蛋白胨10g·L-1。
1.1.3 試劑 Na2HPO4、檸檬酸、蔗糖、EDTA、β-巰基乙醇、PEG、CaCl2、蝸牛酶、纖維素酶、酒石酸鉀鈉、醋酸鈉、冰醋酸和果糖,試驗(yàn)所涉及藥品均為分析純。
1.2.1 菌種活化與擴(kuò)大培養(yǎng) 試驗(yàn)中,由于釀酒酵母和青霉菌冷藏了一段時(shí)間,故需對(duì)其活化1~2代。方法為在試管斜面培養(yǎng)基上,28~30℃培養(yǎng)48 h,然后轉(zhuǎn)接入液體搖瓶中(裝量為100mL/500mL三角瓶),28~30℃,200r·min-1振蕩培養(yǎng)。
1.2.2 原生質(zhì)體制備
酵母菌原生質(zhì)體制備
1)離心洗滌、收集細(xì)胞:分別取5mL上述培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的酵母細(xì)胞培養(yǎng)液,3 000r·min-1離心10min,棄上清液,向沉淀的菌體中加入5mL緩沖液,用無(wú)菌接種環(huán),攪散菌體,振蕩均勻后離心洗滌1次,再用5mL高滲緩沖液離心洗滌1次,收集菌體。
2)酶解脫壁:向收集的菌體中加入3mL脫壁預(yù)處理劑,振蕩均勻,于30℃保溫30min,離心5~10min,棄上清,無(wú)菌水洗滌2次。所用脫壁酶為1.5%蝸牛酶,30 ℃,150r·min-1輕微振蕩,每隔30min取樣鏡檢酶解程度,處理1~2h即可停止酶解處理,加入10%蔗糖溶液低滲沖擊,然后離心5~10min,棄酶液,收集原生質(zhì)體及未酶解細(xì)胞[4-6]。用高滲溶液洗滌,懸浮于原生質(zhì)體保存液。
青霉菌原生質(zhì)體制備:用無(wú)菌接種環(huán)從靜置液體培養(yǎng)的三角瓶中挑出菌膜(對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)),置于無(wú)菌的圓底離心管中,用4mL,加入3mL脫壁預(yù)處理劑,稍微振蕩,于30℃保溫30min,離心5~10 min,棄上清,用4mL,去上清液,加入2%纖維素酶和1%蝸牛酶混合酶液共3mL,同時(shí)加入0.1mL 10%β-巰基乙醇,于30℃水浴酶解3h,間或搖動(dòng)。酶解結(jié)束后,2 500r·min-1離心5min,棄酶液,收集原生質(zhì)體及未酶解細(xì)胞[7-8]。
1.2.3 原生質(zhì)體再生 將原生質(zhì)體稀釋適當(dāng)倍數(shù)后涂于再生高滲培養(yǎng)基平板,28℃培養(yǎng),3~5d后觀察。
1.2.4 原生質(zhì)體融合 取兩親本原生質(zhì)體各1mL,混合于滅菌小試管中,2 500r·min-1離心10min,棄上清液,向上述沉淀菌體中加入2mL促溶劑,輕輕搖勻,32℃水浴保溫30min,取適量,適當(dāng)稀釋后涂布于完全培養(yǎng)基固體平板上,28℃培養(yǎng)3~5d后觀察。
1.2.5 融合子的性能測(cè)定 挑取原生質(zhì)體融合后在以菊粉為唯一碳源的培養(yǎng)基平板上長(zhǎng)出的若干大菌落接種,30℃培養(yǎng)24~48h,后轉(zhuǎn)接于液體完全培養(yǎng)基中。利用其營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記、酶活力的測(cè)定、融合子的酒精發(fā)酵特性、細(xì)胞形態(tài)、體積大小、繁殖速率、發(fā)酵強(qiáng)度等方面的觀察和測(cè)定結(jié)果來(lái)鑒定融合子。
1)融合子菊粉酶活力測(cè)定:菊粉酶的活力分為內(nèi)切酶活力(I)和外切酶活力(S),具體測(cè)定方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[9]。
2)酒精濃度測(cè)定:取100mL成熟發(fā)酵液到蒸餾瓶中,加入100mL水,混勻后蒸餾。取餾出液100mL。用酒精比重計(jì)測(cè)定餾出液中的酒精濃度[10],再校正為20℃時(shí)的酒精濃度。
3)糖分利用率與酒精的實(shí)際出率的計(jì)算參考文獻(xiàn)[11]。
2.1 原生質(zhì)體制備條件的選擇
2.1.1 菌齡 原生質(zhì)體的形成與菌齡有很大關(guān)系,本試驗(yàn)選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的酵母細(xì)胞培養(yǎng)液,培養(yǎng)時(shí)間控制在12h以內(nèi)。絲狀真菌生長(zhǎng)較慢,18h以后肉眼才能看見(jiàn)菌膜,因此,菌齡控制在24h內(nèi),以更好地形成原生質(zhì)體。
2.1.2 脫壁條件的選擇 酵母原生質(zhì)體制備一般選用蝸牛酶作為脫壁酶,本試驗(yàn)所采用的蝸牛酶濃度為1.5%,酶解時(shí)間1~2h。絲狀真菌類原生質(zhì)體制備一般選用蝸牛酶,纖維素酶不同濃度的組合酶系,本試驗(yàn)選擇2%纖維素酶加1%蝸牛酶的混合酶液,絲狀真菌所需脫壁時(shí)間較長(zhǎng),酶解時(shí)間約3h,究其原因可能是菌膜沒(méi)有被搗碎,酶與菌絲體接觸面積小,不利于原生質(zhì)體的釋放。
2.2 原生質(zhì)體的融合及融合子的檢出 采用PEG(MW 6000)促融法,將兩親本等比例混合,PEG濃度為30%,32℃水浴保溫30min。
原生質(zhì)體融合的兩個(gè)親本,其一為可以產(chǎn)生菊粉酶的青霉菌,其二為可以進(jìn)行酒精發(fā)酵的酵母菌,二者融合以后直接采取選擇性培養(yǎng)基鑒定的方法可很容易檢出真正的融合子,挑取原生質(zhì)體融合后長(zhǎng)出的若干大菌落接種在以菊粉為唯一碳源的培養(yǎng)基平板上,30℃培養(yǎng)24~48h。后轉(zhuǎn)接于液體完全培養(yǎng)基中,其融合子的酒精發(fā)酵特性、酶活力測(cè)定、細(xì)胞形態(tài)、體積大小、繁殖速率等方面的觀察和測(cè)定結(jié)果表明,均不同于雙親菌株,因此,可確定為融合子。
2.3 酒精發(fā)酵菌株R8菌落形態(tài) R8菌株在平板上的菌落形態(tài)更接近于酵母菌,只是菌落透明度并不高,同時(shí)沒(méi)有表現(xiàn)出很明顯的青霉菌菌落的形態(tài)(圖1)。
2.4 融合子性能測(cè)定及篩選 通過(guò)對(duì)初步確定的16株融合菌株的進(jìn)一步性能測(cè)定,包括其產(chǎn)菊粉酶的能力、產(chǎn)酒精的能力以及遺傳穩(wěn)定性的研究,最終確定一株利用菊芋發(fā)酵產(chǎn)生酒精的菌株。
圖1 R8菌株平板菌落形態(tài)Fig.1 Morphology of R8strains flat colony
2.4.1 產(chǎn)菊粉酶能力測(cè)定 融合菌株R1、R3、R4、R8、R14產(chǎn)菊粉酶活力均極顯著高于其他各組(P<0.01)(圖2)。為了能從中篩選出產(chǎn)酒精能力強(qiáng)的發(fā)酵菌種,本研究將產(chǎn)菊粉酶活力相對(duì)較好的融合菌株R1、R3、R4、R10、R11、R14,在進(jìn)一步的產(chǎn)酒精能力試驗(yàn)中都作為考察對(duì)象。
2.4.2 產(chǎn)酒精能力的測(cè)定 菌株R3和R8的產(chǎn)酒精能力均極顯著高于其他各組(P<0.01),而且酒精得率均為41.16%(圖3),這可能是因?yàn)榫闞3的酒精耐受性比R8好,R8的產(chǎn)酶能力隨發(fā)酵液中酒精濃度的增加而受到抑制。但考慮到R8產(chǎn)菊粉酶活力高于R3,基本確定R8作為后續(xù)酒精發(fā)酵的菌株。測(cè)定誤差,進(jìn)行數(shù)據(jù)描述和分析。
圖2 R1-R16菊粉酶活力測(cè)定結(jié)果Fig.2 Inulinase activity determination results of R1-R16
圖3 融合菌株酒精發(fā)酵得率測(cè)定Fig.3 Alcohol fermentation rate determination of fusion strains
2.4.3 融合子穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果 融合子R8穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果表明,四代以內(nèi),酒精得率不變,均為41.16%,內(nèi)切酶與外切酶活力有所波動(dòng),均為無(wú)規(guī)律小范圍波動(dòng),穩(wěn)定性相對(duì)良好(表1)。最終選擇融合菌株R8作為進(jìn)行后續(xù)發(fā)酵的菌株。
選用適合釀酒酵母和青霉菌的不同原生質(zhì)體制備條件,經(jīng)融合與鑒定,篩選出了16株融合子,分別對(duì)其產(chǎn)菊粉酶和產(chǎn)酒精能力及其三代以上遺傳穩(wěn)定性做了測(cè)定,最終確定最優(yōu)菌株為R8,內(nèi)切酶活力為8.97U·mL-1,外切酶活力為25.09U·mL-1,酒精得率為41.16%,原料糖分利用率為75.52%,穩(wěn)定性良好。
表1 融合子R8穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果Table 1 Stability of fusion R8
利用原生質(zhì)體融合技術(shù)構(gòu)建出一種可以直接利用菊芋為原料來(lái)發(fā)酵產(chǎn)生酒精的菌種,經(jīng)過(guò)初步的性能測(cè)定,篩選出一種產(chǎn)菊粉酶和產(chǎn)酒精能力較優(yōu)的菌株,為進(jìn)一步提高菊芋酒精發(fā)酵的產(chǎn)量有一定的參考意義。
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