鄭偉，楊智，安殿梅，3，孟冬婭，胡曉芳

（1.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院檢驗科，沈陽 110840；2.沈陽市胸科醫(yī)院檢驗科，沈陽 110044；3.遼寧醫(yī)學院研究生院，遼寧 錦州 121001）

高同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）血癥是腦血管病患者重要的病理特征［1］，也是增加腦血管病發(fā)生的獨立危險因素之一。亞甲基四氫葉酸還原酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）是 Hcy再甲基化途徑的關(guān)鍵酶，其第4號外顯子C677T位發(fā)生錯義突變，堿基胞嘧啶（C）被胸腺嘧啶（T）置換，使酶的耐熱性和活性顯著降低是引起Hcy水平升高主要的遺傳機制之一。而葉酸和維生素B12是Hcy代謝途徑中必需的輔助因子，二者直接影響著Hcy的代謝水平［1］。本研究以腦血管病患者為研究對象，通過測定血清Hcy水平，檢測分析MTHFRC677T基因多態(tài)性并檢測血清葉酸和維生素B12水平，進一步探討腦血管病患者高Hcy血癥的發(fā)生機制，旨在為腦血管病的診斷和治療提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象：選擇2010年3月至2011年3月沈陽軍區(qū)總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科、神經(jīng)外科及急診科病區(qū)腦血管病患者（腦血管病組）177例，其中男99例，女78例，平均年齡（61.22±11.14）歲。其中腦梗死（cerebral infarction，CI）103 例 ， 腦 出 血（cerebral hemorrhage，CH）74例。入組標準：患者均有顱腦CT和（或）MRI的影像證據(jù)，診斷符合1995年全國第4屆腦血管病學術(shù)會議修訂的診斷標準［2］。排除肝、腎疾病、糖尿病、惡性腫瘤、甲狀腺功能異常、妊娠及服用抗驚厥藥物者。無酗酒史，未服用免疫抑制劑、多種維生素及葉酸。對照組為我院健康體檢者122例，其中男 71例，女 51例，平均年齡（60.25±10.30）歲。2組在年齡、性別方面差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

1.1.2 主要儀器與試劑：實時熒光PCR儀（美國ABI公司），紫外分光光度計（日本島津公司），電泳槽及電泳儀（美國EC公司），凝膠成像系統(tǒng)（日本Kodak公司），日立-7600全自動生化分析儀（日本日立公司），AIA-1800全自動化學發(fā)光免疫分析儀（日本奧林巴斯光學株式會社）。全血DNA提取試劑盒（大連寶生物公司），探針（上?；瞪锛夹g(shù)有限公司），PCR反應(yīng)試劑（大連寶生物公司），DNA Marker（大連寶生物公司），Loading buffer（大連寶生物公司），瓊脂糖（Promega公司），EB（Amresco公司），Hcy試劑盒（北京九強生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 標本采集與指標檢測：腦血管病組患者（于確診入院的第1天清晨）以及對照組體檢者在空腹狀態(tài)下采集前臂無抗凝靜脈血和EDTA-K2抗凝靜脈血各3 mL。無抗凝靜脈血1 h內(nèi)離心（3 000 r/min，10 min）分離血清后，置于-70℃保存待測。EDTA-K2抗凝靜脈血置于-70℃冰箱保存，待提取DNA。應(yīng)用日立-7600全自動生化分析儀，采用酶法檢測血清Hcy濃度。應(yīng)用AIA-1800全自動化學發(fā)光免疫分析儀，采用化學發(fā)光免疫法分別檢測葉酸和維生素B12濃度，所有操作嚴格按說明書進行。

1.2.2 全血基因組DNA提取：應(yīng)用全血DNA提取試劑盒提取人全血DNA，所有操作嚴格按照試劑說明書進行。測定各樣品OD260和OD280吸光度值，根據(jù)OD260/OD280值分析DNA樣品的純度。

1.2.3 實時PCR擴增MTHFRC677T基因片段：PCR引物和TaqMan MGB探針序列參考文獻［3］，由上?；瞪镉邢薰竞铣?。PCR產(chǎn)物片段長度為86 bp。MTHFRC677T引物及探針序列如下：PrimerFw：5′-GACCTGAAGCACTTGAAGGAGAA-3′，Primer Rev：5′-GGAAGAATGTGTCAGCCTCAAA G-3′；probe C：FAM-AAATCGGCTCCCGCA-MGB，probeT：HEX-TGAAATCGACTCCCG-MGB。PCR反應(yīng)體系：總體積 25 μL，DNA 模板 2 μL，PCR 反應(yīng)液 10 μL，Primer 1（10 μmol/L）0.5 μL，Primer 2（10 μmol/L）0.5 μL，Probe 1（10 μmol/L）0.5 μL，Probe 2（10 μmol/L）0.5 μL，ROX Reference Dye 0.5 μL，滅菌蒸餾水 10.5 μL。使用美國ABI-7300實時熒光PCR儀，反應(yīng)條件如下：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s，循環(huán) 40 次，60℃時熒光信號檢測。35℃冷卻10 s。PCR擴增完畢后軟件直接分析各基因型。取5 μL PCR產(chǎn)物，行3%的瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計學分析

基因型采用頻率計數(shù)法，用Hardy-Weinberg平衡定律計算等位基因頻率。組間基因型及等位基因頻率比較采用χ2檢驗。計量資料用±s表示，組間比較用t檢驗、方差分析。相關(guān)性分析用Spearman相關(guān)檢驗。以上比較采用SPSS 17.0軟件進行分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 腦血管病組與對照組血清Hcy水平的比較（圖1）

CI、CH組和對照組的血清Hcy水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=19.58，P<0.01）。其中，CI組的血清 Hcy水平［（24.04±6.36）μmol/L］明顯高于 CH 組［（20.39±5.56）μmol/L］，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。

2.2 實時熒光PCR法檢測MTHFRC677T多態(tài)性

應(yīng)用帶有熒光標記的FAM和HEX的TaqMan MGB探針，分別檢測MTHFR基因的CC型、CT型和TT型，根據(jù)熒光信號不同區(qū)分3種基因型。3種基因型及結(jié)果判斷見圖2。PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示，目的基因產(chǎn)物的片段長度為86 bp，見圖3。

2.3 腦血管病組與對照組的MTHFRC677T基因型分布比較

腦血管病組和對照組的MTHFRC677T基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律，各等位基因均達到遺傳平衡，具有群體代表性。腦血管病組和對照組的MTHFRC677T 3種基因型（CC、CT和TT）頻率分別為16.9%、50.3%、32.8%及31.1%、40.2%、28.7%，2組基因型分布差異具有統(tǒng)計學意義（χ2=8.39，P<0.05）。腦血管病組T等位基因頻率（57.9%）明顯高于對照組（48.8%）（χ2=4.86，P<0.01）。其中，CI組與CH組的MTHFRC677T基因型分布和等位基因頻率比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。各組基因型分布及等位基因頻率結(jié)果見表1。

2.4 MTHFRC677T基因多態(tài)性與血清Hcy水平的關(guān)系（圖 4）

CI組、CH組以及對照組TT基因型血清Hcy水平明顯高于CT型和CC型（P<0.01），但CT型和CC型的血清Hcy水平比較無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。

表1 腦血管病組與對照組的M TH FR基因型及等位基因頻率分布Tab.1 Distribution of MTHFR geno type and a lle le frequency in cerebrovascu lardisease group and controlgroup

2.5 腦血管病組與對照組的血清葉酸和維生素B12水平的比較

CI組和CH組血清葉酸、維生素B12水平均明顯低于對照組（P<0.01），但二者比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）（圖5）。相關(guān)分析結(jié)果顯示，腦血管病組的血清葉酸和維生素B12水平與血清Hcy水平呈負相關(guān)（r1=-0.80，r2=-0.83）。

3 討論

高Hcy血癥是腦血管疾病發(fā)病的一個獨立危險因素。研究顯示，Hcy可致血管內(nèi)皮細胞損傷和功能紊亂，引起脂蛋白和膽固醇在血管壁沉積，并可滅活血管舒張因子一氧化氮，從而促進動脈粥樣硬化的發(fā)生和血栓形成［4］。本研究結(jié)果顯示，CI患者血清Hcy水平明顯高于正常對照組，提示血清Hcy水平與CI的發(fā)病密切相關(guān)。

有研究顯示，Hcy還可通過促進血栓素和前列腺素形成而影響血小板聚集和凝血因子的活性。因此，血清Hcy濃度的升高對CH的發(fā)生和發(fā)展起重要作用［5］。本研究結(jié)果顯示，CH患者血清Hcy水平明顯升高，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義，提示高Hcy血癥參與CH的發(fā)病。值得關(guān)注的是，CI組血清Hcy水平明顯高于CH組，進一步提示Hcy可能通過不同的作用機制或不同強度的病理反應(yīng)分別參與CI和CH的發(fā)病。然而目前關(guān)于腦血管病患者高Hcy血癥發(fā)生的機制尚未充分闡明。

MTHFR是Hcy再甲基化途徑的關(guān)鍵酶，編碼此酶基因第4號外顯子C677T位點發(fā)生錯義突變是引起該酶缺乏、活性降低從而引起血清Hcy水平升高的主要遺傳機制［6］。研究證實，MTHFRC677T基因多態(tài)性與腦血管病的發(fā)生密切相關(guān)［7］。本研究采用TaqMan實時PCR技術(shù)檢測MTHFRC677T基因多態(tài)性，研究結(jié)果顯示，MTHFRC677T基因型及等位基因頻率在腦血管病組與對照組存在統(tǒng)計學差異。其中腦血管病組TT基因型頻率（32.8%）及T等位基因頻率（57.9%）明顯高于健康對照組（28.7%、48.8%，P<0.05），而 CI組與 CH 組相比，MTHFRC677T基因型及等位基因頻率差異均無統(tǒng)計學意義。由此進一步證實，MTHFRC677T的T等位基因是腦血管病發(fā)病的易感基因。值得關(guān)注的是，本研究中腦血管病組T等位基因攜帶頻率（57.9%）明顯高于國、內(nèi)外其他地區(qū)［8］，可能與研究人群的種族和所在地域有關(guān)［9］。本研究還發(fā)現(xiàn)MTHFR的TT型血清Hcy水平明顯高于CT型和CC型，而CT型與CC型相比，無統(tǒng)計學差異。提示MTHFRC677T的T等位基因突變是引起血清Hcy水平升高的關(guān)鍵因素。

另有研究顯示，葉酸和維生素B12均參與和影響Hcy的代謝，葉酸的激活使Hcy甲基化成為蛋氨酸。因此，葉酸和維生素B12的缺乏均可致高Hcy血癥的發(fā)生［10］。本研究結(jié)果顯示，腦血管病組的血清葉酸和維生素B12水平均明顯低于對照組，與此相反，腦血管病組血清Hcy水平顯著高于對照組，且血清葉酸、維生素B12水平與血清Hcy水平呈負相關(guān)。更為重要的是，已有研究證實，補充葉酸和維生素B12可有效降低血清Hcy水平，能有效預(yù)防和減少腦血管病的發(fā)生［11］，提示葉酸和維生素B12與Hcy可能存在負反饋的調(diào)節(jié)機制。腦血管病的發(fā)生可能正是這種調(diào)節(jié)機制失衡的結(jié)果。基于以上發(fā)現(xiàn)，我們有理由推測，血清Hcy水平不僅與其相關(guān)代謝酶基因突變有關(guān)，還與其代謝輔助因子密切相關(guān)。另有研究顯示，MTHFRC677T突變可降低體內(nèi)葉酸儲備水平［12］。由此可以推測，腦血管病患者低水平葉酸血癥的發(fā)生同樣依賴于MTHFR基因突變。

腦血管病是一種多因素所致的復(fù)雜性疾病，其中，高Hcy血癥是導致腦血管病發(fā)生的獨立危險因素。而影響Hcy代謝途徑的遺傳和營養(yǎng)因素，正是導致高Hcy血癥發(fā)生的關(guān)鍵因素。MTHFRC677T的T等位基因是腦血管病發(fā)病的易感基因，此基因突變是引起血清Hcy水平升高的主要遺傳因素。與此同時，低水平的葉酸和維生素B12與高Hcy血癥的發(fā)生密切相關(guān)。

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