孫毅凡 李海成 周杰 錢明 陳濤 江勇 賴賽麟 江振友 鐘球 周琳

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的。據(jù)報(bào)道，2010年全球結(jié)核病新增患者約有880萬(wàn)［1］。我國(guó)結(jié)核病年發(fā)病人數(shù)約為130萬(wàn)，占全球發(fā)病的14%，位居全球第2位［2］。我國(guó)結(jié)核病疫情仍很嚴(yán)重，因此圍繞研發(fā)保護(hù)性疫苗、改進(jìn)診斷技術(shù)一直是結(jié)核病基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)。

結(jié)核分枝桿菌能分泌大量的免疫原性蛋白，其中由Rv3803c基因編碼的MPT51蛋白，與Ag85復(fù)合體有很大程度的同源性［3］，其可能作為有效的保護(hù)性抗原在結(jié)核分枝桿菌感染免疫中發(fā)揮重要作用。SodA由結(jié)核分枝桿菌Rv3846基因編碼，是一種由致病性分枝桿菌大量分泌的毒力因子，可將宿主巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的氧自由基轉(zhuǎn)換為過(guò)氧化氫［4］，從而對(duì)抗巨噬細(xì)胞的氧化攻擊。筆者克隆表達(dá)了Rv3803c、Rv3846基因，對(duì)其編碼的蛋白 MPT51、SodA進(jìn)行純化鑒定，為進(jìn)一步探討相關(guān)分泌抗原的輔助診斷價(jià)值，構(gòu)建保護(hù)性疫苗及篩選藥物靶點(diǎn)等奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材料和方法

一、菌種和載體

Mtb H37Rv標(biāo)準(zhǔn)菌株為本中心保存，大腸埃希菌（E．coli）TOP10菌株、E．coli Rosetta菌株購(gòu)自中國(guó)Transgen公司，pGEX－6P－1載體（氨芐青霉素抗性，多克隆位點(diǎn)BamHⅠ，EcoRⅠ，SmaⅠ，SalⅠ，XhoⅠ，NotⅠ）購(gòu)自美國(guó)GE公司。

二、酶和試劑

限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、Pyrobest DNA聚合酶均購(gòu)自日本TaKaRa公司，谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（anti－GST）鼠單抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruse公司，辣根過(guò)氧化物酶（HRP）偶聯(lián)的兔抗鼠二抗購(gòu)自美國(guó)promega公 司，異 丙 基－β－D－硫 代 吡 喃 半 乳 糖 苷（IPTG）、苯甲基磺酰氟（PMSF）、氨芐青霉素、還原性谷胱甘肽購(gòu)自鼎國(guó)生物公司，Glutathione Sepharose 4B購(gòu)自美國(guó)GE公司，電化學(xué)發(fā)光液（electrochemiluminescence，ECL）購(gòu)自美國(guó)Pierce公司。

三、Rv3803c、Rv3846基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建、表達(dá)和純化方法

（一）基因克隆和鑒定

以H37Rv基因組DNA為模板分別擴(kuò)增Rv3803c、Rv3846。

Rv3803c上 游 引 物：5′－GTACATGGATCCATGAAGGGTCGGTCGGCGCTGCTGC－3′； 下游引物：5′－GTACATCTCGAGTTAGCGGATCGCACCGACGATATCG－3′。

Rv3846上 游 引 物：5′－GTACATGGATCCATGGCCGAATACACCTTGCCAGACC－3′； 下游 引 物：5′－GTACATCTCGAGTCAGCCGAATATCAACCCCTTGGTC－3′。

Rv3803c的PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：94℃3min，94℃ 30s，65℃ 1min，72℃ 70s，30個(gè)循環(huán)；Rv3846的PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：94℃3min，94℃30s，62℃1min，72℃1min，30個(gè)循環(huán)。

PCR產(chǎn)物經(jīng)BamHⅠ、XhoⅠ內(nèi)切酶酶切之后，1%瓊脂糖凝膠電泳后回收目的條帶，T4連接酶連接到表達(dá)載體 pGEX－6P－1，轉(zhuǎn)化到E．coliTOP10中，送美國(guó)Invitrogen公司中國(guó)分部測(cè)序。

（二）重組質(zhì)粒的構(gòu)建和誘導(dǎo)表達(dá)

把測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E．coli Rosetta中，準(zhǔn)備表達(dá)重組蛋白。挑單克隆于5ml含50μg／ml氨芐青霉素的LB（lysogeny broth，溶菌肉湯）培養(yǎng)基中過(guò)夜活化培養(yǎng)，第二天以1∶100的體積接種到200ml含50μg／ml氨芐青霉素的新鮮LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至A600＝0．5～0．6時(shí)，加入終濃度為0．4mmol／L的IPTG，16℃誘導(dǎo)培養(yǎng)8h。

（三）重組蛋白免疫印跡（Western blot）鑒定

1．免疫印跡鑒定：取大約1個(gè)A600量（1×109）的菌，超聲破菌（100W 功率，超聲發(fā)射5s，靜止10s，連續(xù)進(jìn)行5min），4℃，20 000g離心15min，分開(kāi)上清液和沉淀；為了檢測(cè)目的蛋白在上清（可溶）還是沉淀（包涵體）中，上清和沉淀分別加入等量的電泳上樣緩沖液，沸水浴煮6min。取5μl進(jìn)行SDS－PAGE（十二烷基磺酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠）電泳。電泳后半干轉(zhuǎn)膜（15V，45min）。轉(zhuǎn)印后的PVDF（聚偏氟乙烯）膜用含5%脫脂奶粉的PBS（磷酸鹽緩沖液）室溫封閉1h，anti－GST單抗1∶2000室溫標(biāo)記1h，HRP偶聯(lián)的兔抗鼠二抗1∶5000標(biāo)記1h，加入ECL液顯影。

2．考馬斯亮藍(lán)染色鑒定：純化蛋白和BSA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行SDS－PAGE電泳。電泳后的SDS－PAGE膠用考馬斯亮藍(lán)染液過(guò)夜染色，然后用脫色液脫色至條帶清晰出現(xiàn)。

3．表達(dá)產(chǎn)物的純化：3000g離心10min，收集誘導(dǎo)后的菌體，10ml含2mmol PMSF的PBS重懸，超聲破菌（100W功率，超聲發(fā)射5s，靜止10s，連續(xù)進(jìn)行5min）；4℃，20 000g離心15min，上清液加入100μl Glutathione Sepharose 4B微珠，4℃孵育12h。4℃，500g離心5min收集微珠，用含1%tritonX－100（聚乙二醇辛基苯基醚－100）的PBS液洗3次，最后用含10mmol／L還原性谷胱甘肽的50mmol／L pH8．0的Tris－HCl（三羥甲基氨基甲烷）洗脫蛋白。

結(jié) 果

1．Rv3803c、Rv3846基因擴(kuò)增結(jié)果：以 H37Rv為模板，分別擴(kuò)增得到大約900bp、600bp的基因片段（圖1），與Rv3803c、Rv3846基因的理論值相符。限制性內(nèi)切酶消化后，連接到pGEX－6p－1載體上，構(gòu)建pGEX－Rv3803c、pGEX－Rv3846重組質(zhì)粒。測(cè)序后與H37Rv比對(duì)顯示：重組質(zhì)粒Rv3803c、Rv3846編碼基因與H37Rv上基因核苷酸序列完全一致。

圖1 A：Rv3803c基因PCR擴(kuò)增結(jié)果（900bp）；B：Rv3846基因PCR擴(kuò)增結(jié)果（620bp）

2．GST－Rv3803c和 GST－Rv3846重組蛋白在E．coli中表達(dá)的可溶性分析：含有重組質(zhì)粒的E．coli Rosetta用1mmol IPTG 誘導(dǎo)后，超聲破碎菌，20 000g離心15min，分開(kāi)上清液（可溶性部分）和沉淀（包涵體），等體積加入上樣緩沖液，Western blot鑒定。GST－Rv3803c和 GST－Rv3846兩個(gè)重組蛋白在上清液（可溶性部分）和沉淀（包涵體）中的含量大致相等（圖2），故其在E．coli Rosetta中的存在形式均為可溶部分約50%，包涵體形式約50%，相對(duì)分子質(zhì)量分別約為56 000和45 000。

圖2 GST－Rv3803c和GST－Rv3846融合蛋白在E．coli中表達(dá)的可溶性分析

3．重組蛋白純化結(jié)果鑒定：含有重組質(zhì)粒的E．coli Rosetta誘導(dǎo)并超聲破碎的上清液與Glutathione Sepharose 4B微珠孵育，親和純化目的重組蛋白。純化后的目的重組蛋白進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色（圖3A）和 Western blot（圖3B）鑒定。有完整的融合蛋白被純化出來(lái)，純化的GST－Rv3803c、GST－Rv3846樣品純度90%以上，但由于GST－Rv3803c純化后降解較嚴(yán)重，最終只能得到10%未降解的完整蛋白。完整的GST－Rv3803c的濃度大約為0．1mg／ml，完整的GST－Rv3846的濃度大約為0．5mg／ml。相當(dāng)于每升E．coli Rosetta培養(yǎng)物中，GST－Rv3803c產(chǎn)量為：0．25mg／L、GST－Rv3846產(chǎn)量為1．25mg／L。

圖3 A：GST－Rv3803c和GST－Rv3846融合蛋白親和純化及考馬斯亮藍(lán)染色鑒定；B：GST－Rv3803c和GST－Rv3846融合蛋白親和純化及 Western blot鑒定

討 論

近年來(lái)，結(jié)核分枝桿菌分泌性蛋白的相關(guān)研究一直備受關(guān)注。目前對(duì)多種分泌性蛋白的研究發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)期分泌的蛋白，如MPT51、SodA等在結(jié)核感染免疫中發(fā)揮了重要作用，為構(gòu)建保護(hù)性疫苗提供了新的思路。

MPT51蛋白的編碼基因是Rv3803c，又稱fbpC1。其相對(duì)分子質(zhì)量約為27 000，是一種非催化性的α／β水解酶，且與Ag85復(fù)合體有較高同源性。MiKi等［5］報(bào)道，MPT51可在小鼠的脾細(xì)胞中介導(dǎo)Ⅰ型細(xì)胞免疫。Bethunaickan等［6］以重組Rv3803c為抗原對(duì)結(jié)核患者IgG、IgA、IgM水平進(jìn)行檢測(cè)，IgG特異度為98%，IgG＋I(xiàn)gA敏感度為71%，均顯著高于健康對(duì)照組，具有一定的診斷價(jià)值。Siev等［7］發(fā)現(xiàn)，HIV感染和未感染的結(jié)核和非結(jié)核患者中，抗MPT51的抗體檢測(cè)在血清和血漿樣品中顯著相關(guān)。此外，MPT51作為候選蛋白在構(gòu)建疫苗中的免疫學(xué)作用也受到關(guān)注。Silva等［8］發(fā)現(xiàn)重組MPT51／CpG的DNA疫苗接種能夠?yàn)榻Y(jié)核感染小鼠模型提供一定的保護(hù)作用。Wang等［9］的研究也表明，其在結(jié)核感染中發(fā)揮關(guān)鍵的保護(hù)作用。因此，純化出MPT51，可為進(jìn)一步探討其輔助診斷價(jià)值、構(gòu)建保護(hù)性疫苗等做出必要準(zhǔn)備。

超氧化物歧化酶（SOD）是需氧微生物普遍存在的一種催化超氧自由基轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫的金屬酶。結(jié)核分枝桿菌中有2種SOD，其中SodA由Rv3846基因編碼，對(duì)病原體有明顯的保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn)SodA的分泌依賴一種輔助分泌因子Sec2，此種Sec2依賴性的蛋白輸出方式參與某種特異性分泌系統(tǒng)，是結(jié)核分枝桿菌逃避宿主Mφ氧化攻擊的毒力機(jī)制之一［10］。結(jié)核感染動(dòng)物模型中，降低結(jié)核分枝桿菌SOD的產(chǎn)生，可加快單核細(xì)胞向肺部浸潤(rùn)及細(xì)胞凋亡，提示SOD在結(jié)核致病過(guò)程中發(fā)揮重要作用［11］。Khera等［12］發(fā)現(xiàn)表達(dá) SOD 的 DNA 疫苗能產(chǎn)生較高水平的IFN－γ，且保護(hù)作用最強(qiáng)。新近文獻(xiàn)報(bào)道，SodA在BCG中的過(guò)量表達(dá)可導(dǎo)致BCG的免疫效力喪失［13］。以上各項(xiàng)結(jié)果說(shuō)明純化鑒定分泌抗原SodA，對(duì)深入研究SodA的分子致病機(jī)制，探討其作為疫苗候選蛋白的可能性建立了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

本研究以pGEX－6P－1為載體，在E．coli Rosetta菌中誘導(dǎo)表達(dá)，其補(bǔ)充了E．coli缺乏的6種稀有密碼子（AUA，AGG，AGA，CUA，CCC，GGA）對(duì)應(yīng)的tRNA，可明顯提高外源基因在原核系統(tǒng)中的表達(dá)水平。采用GST標(biāo)簽親和層析法成功純化出了GST－Rv3803c和GST－Rv3846蛋白，以期進(jìn)一步探討結(jié)核分枝桿菌分泌性蛋白MPT51、SodA在與宿主巨噬細(xì)胞相互作用時(shí)，Toll樣受體、細(xì)胞凋亡等相關(guān)信號(hào)通路變化，以及細(xì)胞因子相關(guān)免疫平衡等分子免疫機(jī)制及其在結(jié)核防治轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。

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