許婉華 黃業(yè)倫 劉燕文 胡麗環(huán) 羅少珍 孟繁榮 劉志輝

結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（Mycobacterium tuberculosiscomplex，MTBC）特異性分泌蛋白 MPT64的發(fā)現(xiàn)、免疫膠體金法檢測方法的創(chuàng)立及相關(guān)檢測試劑的成功研發(fā)，為分枝桿菌培養(yǎng)物的MTBC與非結(jié)核分枝桿菌（non－tuberculous mycobacteria，NTM）的鑒定帶來了極大的便利［1－2］。筆者在應(yīng)用 MPT64分泌蛋白檢測鑒定MTBC的研究中還發(fā)現(xiàn)：不管是采用液體培養(yǎng)基還是固體培養(yǎng)基，只要有MTBC生長，在絕大多數(shù)情況下均可檢測到MPT64分泌蛋白［3］。這就提示人們MPT64蛋白的分泌可以作為MTBC的生長指示而成為MTBC培養(yǎng)的檢測標(biāo)志物，而且目前的研究表明MPT64為MTBC早期分泌蛋白，應(yīng)用其作為MTBC生長檢測標(biāo)志物可能具有快速的特點(diǎn)，筆者的初步研究結(jié)果證實(shí)了這一特點(diǎn)［4］。為進(jìn)一步確證這一實(shí)驗(yàn)方法的檢測效能，筆者進(jìn)行了大樣本量的對(duì)照研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

材料和方法

一、臨床樣本來源

2010年8月至2010年12月我院結(jié)核病防治所門診2064例患者送檢的分枝桿菌分離培養(yǎng)標(biāo)本，其中2012例痰標(biāo)本、12例胸腔積液標(biāo)本、40例支氣管灌洗液標(biāo)本。

二、儀器和試劑

儀器分析法采用BACTEC MGIT 960分枝桿菌快速培養(yǎng)系統(tǒng)；培養(yǎng)基應(yīng)用儀器系統(tǒng)專用培養(yǎng)基（美國BD公司生產(chǎn)），主要成分為 Middlebrook 7H9；MPT64抗原免疫膠體金法檢測試劑盒購自杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司。

三、研究方案設(shè)計(jì)

以目前人們公認(rèn)檢測性能優(yōu)良的BACTEC MGIT 960分枝桿菌快速培養(yǎng)儀器法（簡稱“儀器法”）為參照，分析培養(yǎng)濾液MPT64抗原檢測法（簡稱“MPT64檢測法”）指示MTBC生長的準(zhǔn)確性和快速性?？紤]到MPT64檢測法不能實(shí)現(xiàn)連續(xù)監(jiān)測，則根據(jù)成本－效益原則將整個(gè)研究分為3個(gè)階段：（1）參照國家關(guān)于新型實(shí)驗(yàn)方法臨床驗(yàn)證強(qiáng)制性樣本量要求，采用雙盲方法對(duì)一定數(shù)量儀器法已經(jīng)報(bào)告結(jié)果（包括陽性、陰性和污染）的分枝桿菌培養(yǎng)瓶培養(yǎng)濾液進(jìn)行一次MPT64抗原檢測，初步評(píng)估MPT64檢測法的準(zhǔn)確性。（2）在培養(yǎng)的第7、14、21、28、35、42天（即第1～6周末）與儀器法同步進(jìn)行培養(yǎng)濾液MPT64抗原檢測，以“周”為時(shí)間單位比較兩種方法各周的累積陽性檢出率（%），分析其快速性能。（3）綜合前2個(gè)階段的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以儀器法為參照標(biāo)準(zhǔn)，分析對(duì)于全部標(biāo)本和儀器法陽性標(biāo)本MPT64檢測法的符合率（%），分析MPT64檢測法的準(zhǔn)確性。

四、實(shí)驗(yàn)方法

1．儀器法：主要實(shí)驗(yàn)步驟包括標(biāo)本收集與前處理、標(biāo)本接種、上機(jī)與儀器監(jiān)測、儀器報(bào)告陽性標(biāo)本的涂片確認(rèn)及MTBC與NTM分群等。標(biāo)本收集與前處理嚴(yán)格按BACTEC MGIT 960分枝桿菌快速培養(yǎng)儀推薦方法進(jìn)行；儀器培養(yǎng)檢測步驟按儀器說明書進(jìn)行；儀器報(bào)告陽性者經(jīng)涂片抗酸染色法確認(rèn)，抗酸染色陽性者報(bào)告“有抗酸桿菌生長”，陰性者報(bào)告“污染”；MTBC與NTM分群應(yīng)用對(duì)硝基苯甲酸（paranitrobenzoic acid，PNB）培養(yǎng)生長試驗(yàn)，1個(gè)月未見菌落生長者為MTBC。

2．MPT64檢測法：按研究設(shè)計(jì)方案適時(shí)對(duì)培養(yǎng)濾液進(jìn)行MPT64抗原檢測，具體檢測方法和結(jié)果判讀按試劑盒說明書嚴(yán)格進(jìn)行：在生物安全柜中，以無菌方法取培養(yǎng)液約0．1ml加入試劑檢測孔中，15min后觀察結(jié)果，1h內(nèi)觀察完畢；檢測線和質(zhì)量控制（簡稱“質(zhì)控”）線均出現(xiàn)紫紅色條帶為陽性，質(zhì)控線出現(xiàn)檢測線未出現(xiàn)紫紅色條帶者為陰性，質(zhì)控線未出現(xiàn)者表示試劑存在問題而必須重新檢測。并且在第2研究階段強(qiáng)調(diào)：在儀器系統(tǒng)監(jiān)測時(shí)點(diǎn)間隔間（筆者的儀器設(shè)置整點(diǎn)為檢測時(shí)點(diǎn)）取出適量標(biāo)本，所取標(biāo)本必須在監(jiān)測時(shí)點(diǎn)間隔內(nèi)完成檢測操作并放回儀器系統(tǒng)，以免影響儀器對(duì)分枝桿菌生長的檢測。在本實(shí)驗(yàn)研究中，納入第1、2階段研究的樣本量分別為799例和1265例樣本。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

和儀器法比較：應(yīng)用χ2檢驗(yàn)對(duì)所有2064例樣本檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并計(jì)算于全部標(biāo)本和儀器法陽性標(biāo)本MPT64檢測法的符合率（%），評(píng)估MPT64檢測法的準(zhǔn)確度；以“周”為時(shí)間單位比較兩種方法各周的累積陽性檢出率（%），并應(yīng)用t檢驗(yàn)比較分析MPT64檢測法的快速性。兩種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法均以P＜0．05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、兩種方法檢測結(jié)果比較

對(duì)于2064例分枝桿菌培養(yǎng)的臨床標(biāo)本，儀器法報(bào)告298例MTBC、108例NTM、1521例培養(yǎng)陰性及137例污染（后三者即無MTBC生長），其中分別有279、6、0、2例 MPT64檢測陽性，即 MPT64檢測法可報(bào)告有MTBC生長，兩者間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝0．12，P＝0．742）。與儀器法的總體一致性為98．69%（2037／2064），對(duì)儀器法報(bào)告為 MTBC者M(jìn)PT64檢測法的陽性率為93．62%（279／298），具有較高的陽性符合水平（表1）。

二、兩種方法1～6周陽性檢測結(jié)果比較

每周進(jìn)行MPT64監(jiān)測的1265例培養(yǎng)液樣本中，兩種方法均檢測到MTBC者168例，其中：儀器法在培養(yǎng)1～6周儀器報(bào)告陽性率分別為25．60%（43／168）、66．67%（112／168）、92．26%（155／168）、98．21%（165／168）、98．81%（166／168）和100．00%（168／168），MPT64檢測法的陽性檢出率則分別為17．26% （29／168）、61．90% （104／168）、89．88%（151／168）、95．24%（160／168）、98．81%（166／168）和100．00%（168／168）。兩者陽性報(bào)告時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝1．68，P＝0．366）（表2）。

討 論

創(chuàng)建準(zhǔn)確、快速、簡便、經(jīng)濟(jì)的結(jié)核病病原學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷方法一直是人們追求的目標(biāo)，但無論是以菌落生長為觀察終點(diǎn)的傳統(tǒng)固體培養(yǎng)方法、還是以監(jiān)測分枝桿菌呼吸活動(dòng)的各種儀器系統(tǒng)快速培養(yǎng)法、亦或是以特定基因序列為檢測靶標(biāo)的各類分子技術(shù)以及其他的實(shí)驗(yàn)技術(shù)（如噬菌體生物擴(kuò)增法、變色培養(yǎng)基法等），迄今為止仍無一種實(shí)驗(yàn)方法盡如人意。本研究評(píng)估的MPT64檢測法是否可以解決部分問題？目前鮮見同類文獻(xiàn)報(bào)道。

從本研究檢測結(jié)果看，無論是對(duì)于整體樣本還是MTBC陽性樣本，MPT64檢測法和目前檢測效能優(yōu)良但實(shí)驗(yàn)費(fèi)用不菲且需專門儀器的BACTEC MGIT 960分枝桿菌快速培養(yǎng)儀器法間具有高度的一致性，說明其準(zhǔn)確性可以與儀器法相媲美。從陽性樣本報(bào)告時(shí)間看，兩者陽性報(bào)告時(shí)間非常接近，但儀器報(bào)告陽性時(shí)間并不能直接代表實(shí)驗(yàn)報(bào)告時(shí)間，實(shí)驗(yàn)報(bào)告時(shí)間還需加上抗酸桿菌確認(rèn)、MTBC與NTM分群等實(shí)驗(yàn)時(shí)間，如本研究分群采用的PNB培養(yǎng)生長試驗(yàn)則需4周之久。因此，可以毫無疑問地認(rèn)為MPT64檢測法比儀器法更為快速。實(shí)驗(yàn)操作程序簡單，MPT64檢測法可直接報(bào)告“有MTBC生長”，不需要儀器法的后續(xù)步驟，且其實(shí)驗(yàn)操作本身也極其簡單（只須以無菌方法取培養(yǎng)液0．1ml加入試劑檢測孔中一個(gè)簡單操作，15min后即可觀察結(jié)果）。而且，MPT64檢測法國內(nèi)有上市的試劑盒，也不需要任何儀器設(shè)備，亦不需要儀器法的后續(xù)實(shí)驗(yàn)費(fèi)用，與需要進(jìn)口專門儀器與專用試劑的儀器法相比，檢測費(fèi)用相對(duì)較低，符合實(shí)驗(yàn)方法的經(jīng)濟(jì)性原則。另外，本研究儀器法報(bào)告為“NTM”或“污染”的245例樣本中MPT64檢測法有8例呈現(xiàn)陽性，也許可以認(rèn)為其對(duì)與其他細(xì)菌混合生長的MTBC具有較強(qiáng)的甄別能力。綜上所述，MPT64檢測法具有準(zhǔn)確、快速、簡便、經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，值得在臨床中推廣應(yīng)用，尤其適合在基層醫(yī)療單位開展。

表1 2064例分枝桿菌培養(yǎng)濾液MPT64檢測結(jié)果與儀器法檢測比較（例）

表2 1265例分枝桿菌培養(yǎng)中168株MTBC在兩種方法中的陽性檢出時(shí)間（例）

當(dāng)然，MPT64檢測法也存在一定的缺陷，筆者認(rèn)為至少有三：一是不能實(shí)現(xiàn)連續(xù)監(jiān)測，在培養(yǎng)時(shí)間終點(diǎn)檢測會(huì)大大影響其快速性，實(shí)施多時(shí)點(diǎn)檢測則會(huì)較大增加實(shí)驗(yàn)成本；二是目前的研究表明一些MTBC菌株可能不分泌 MPT64蛋白［3，5］，這會(huì)相對(duì)降低本實(shí)驗(yàn)方法對(duì)MTBC的檢測能力；三是不能檢測樣本中的NTM，丟失了分枝桿菌培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)本來固有的部分臨床意義。這些問題均值得進(jìn)行深入研究，更加希望研究成果能夠快速面世，以滿足結(jié)核病臨床診療的迫切需要。

［1］Abe C，Hirano K，Tomiyama T．Simple and rapid identifica－tion of theMycobacterium tuberculosiscomplex by immunochromatographic assay using anti－MPB64monoclonal antibodies．J Clin Microbio，1999，37（11）：3693－3697．

［2］Fabre M，Vong R，Gaillard T，et al．Evaluation of the SD BIOLINE TB Ag MPT64Rapid?for the diagnosis of tuberculosis．Pathol Biol（Paris），2011，59（1）：26－28．

［3］劉志輝，蔡杏珊，劉玉美，等．MPB64分泌蛋白檢測鑒定結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的應(yīng)用研究．國際呼吸雜志，2010，30（18）：1100－1103．

［4］何霞，譚守勇，羅春明，等．應(yīng)用MPT64為靶標(biāo)快速檢測結(jié)核分枝桿菌生長的研究．廣東醫(yī)學(xué)，2010，31（2）：222－224．

［5］吳雪瓊．結(jié)核分枝桿菌保護(hù)性抗原的研究進(jìn)展．中華結(jié)核和呼吸雜志，2006，29（4）：340－342．