坐骨神經(jīng)阻滯對(duì)后足切割大鼠脊髓中腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)的影響

張慧君，萬(wàn)培玲，王 穎

(海南省人民醫(yī)院麻醉科1、藥學(xué)部2，海南 海口 570311)

坐骨神經(jīng)阻滯對(duì)后足切割大鼠脊髓中腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)的影響

張慧君1，萬(wàn)培玲2*，王 穎1

(海南省人民醫(yī)院麻醉科1、藥學(xué)部2，海南 ?？?570311)

目的 探究坐骨神經(jīng)阻滯能否影響大鼠后足切割后脊髓背角中腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)表達(dá)的升高。方法雄性SD大鼠32只，體重150～250 g，隨機(jī)分為兩組，各16只。坐骨神經(jīng)阻滯組大鼠先行坐骨神經(jīng)阻滯后后足切割手術(shù)，全麻組在全麻下行后足切割手術(shù)。兩組均于術(shù)后1 h、6 h、1 d、3 d各取4只大鼠處死，檢測(cè)腰段脊髓背角中BDNF的水平。結(jié)果后足切割后1 h、6 h、1 d，全麻組大鼠切割側(cè)腰段脊髓背角中BDNF水平顯著高于對(duì)側(cè)(P＜0.05)，坐骨神經(jīng)阻滯組大鼠切割側(cè)腰段脊髓背角中BDNF水平未見明顯變化(P＞0.05)，兩組大鼠切割后1 h、6 h、1 d切割側(cè)腰段脊髓背角中BDNF水平間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論坐骨神經(jīng)阻滯能顯著抑制大鼠后足切割引起的腰段脊髓背角中BDNF的表達(dá)升高。

腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子；后足切割；疼痛；大鼠；脊髓；坐骨神經(jīng)阻滯

腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族中的重要一員。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中，BDNF對(duì)神經(jīng)元的存活、分化、生長(zhǎng)發(fā)育起重要作用，并能防止神經(jīng)元受損、死亡，改善神經(jīng)元的病理狀態(tài)，促進(jìn)受損神經(jīng)元再生及分化。研究表明，無(wú)論是周圍組織炎癥還是神經(jīng)干損傷，都會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)神經(jīng)支配區(qū)域的脊髓和背根神經(jīng)節(jié)中BDNF表達(dá)上調(diào)[1-3]。我們前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大鼠后足切割后，切割側(cè)腰段脊髓背角BDNF表達(dá)迅速升高且定位于神經(jīng)元[4]。由此，我們推測(cè)脊髓中BDNF升高與軸突運(yùn)輸、電活動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)研究坐骨神經(jīng)阻滯能否影響大鼠后足切割引起的脊髓中的表達(dá)升高。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物選擇及分組 雄性SD大鼠32只(中南大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，體重150～250 g，隨機(jī)分為全麻組、坐骨神經(jīng)阻滯組，每組16只(n= 16)。分別于后足切割手術(shù)后1 h、6 h、1 d、3 d各取4只處死，進(jìn)行免疫組化檢測(cè)脊髓背角中BDNF的水平。

1.2 主要儀器與試劑 冰凍切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)顯微鏡和顯微照相系統(tǒng)(日本Olympus公司)，圖像分析系統(tǒng)(Motic images advance)，多克隆兔抗鼠BDNF(Santa Cruz公司)，生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG (北京中山生物工程公司)。

1.3 大鼠切口疼痛模型 全麻組應(yīng)用1.5%異氟醚氧氣麻醉成功后，消毒大鼠右后足，依Zahn等[5]描述的方法從足底近端0.5 cm處向趾部做長(zhǎng)約1 cm的縱行切口，切開皮膚后，用眼科鑷挑起足底肌肉并縱行切割至骨膜。按壓止血后，縫合切口。要求切口皮膚不能重疊、內(nèi)翻，亦不可裂開。傷口消毒并涂抹紅霉素軟膏。坐骨神經(jīng)阻滯組在阻滯成功后大鼠即下肢癱瘓，痛覺喪失，切割時(shí)不掙扎，助手撫慰大鼠即可依照全麻組方法完成手術(shù)。

1.4 免疫組織化學(xué)染色 依照Z(yǔ)hou等[6]的方法完成脊髓的免疫組化。

1.5 圖像分析 應(yīng)用HPIAS-1000圖像分析軟件(Tongji Qingping Company，PRC)進(jìn)行圖像分析。應(yīng)用連接與顯微鏡的數(shù)碼相機(jī)(Nikon)獲取圖像，確保所有待分析圖像均為原始圖像。在每個(gè)樣本隨機(jī)抽取5部分，每個(gè)部分隨機(jī)采取5個(gè)視野用于圖像分析。密度達(dá)到背景5倍以上的細(xì)胞則確定為陽(yáng)性細(xì)胞。為了確定細(xì)胞BDNF免疫反應(yīng)的強(qiáng)度，我們首先評(píng)估相對(duì)陽(yáng)性染色的相對(duì)視覺強(qiáng)度(OD)。在放大200倍視野中，測(cè)量背根神經(jīng)節(jié)和脊髓中陽(yáng)性細(xì)胞的OD值，應(yīng)用Zhou等[6]描述的方法計(jì)算平均OD值和陽(yáng)性細(xì)胞比例。上述計(jì)算均由不知道結(jié)論的第三人完成。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)應(yīng)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)描述。數(shù)據(jù)處理利用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包的單因素方差分析(One-way ANOVA)和Dunnett t檢驗(yàn)，以P＜0.05作為判斷差異顯著性的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

全麻組大鼠后足切割后同側(cè)腰段脊髓背角中BDNF水平上升。后足切割后1 h，相對(duì)于對(duì)側(cè)，切割側(cè)腰段脊髓背角中BDNF水平上升(P＜0.05，圖1A)。BDNF水平于切割后6 h達(dá)到峰值(P＜0.05，圖1B)。在切割1 d后BDNF水平仍明顯高于對(duì)側(cè)(P＜0.05，圖1C)，而切割3 d后，BDNF水平較對(duì)照組無(wú)明顯差別(圖1D)，見表1。坐骨神經(jīng)阻滯組大鼠后足切割后1 h、6 h、1 d、3 d切割側(cè)腰段脊髓背角中BDNF水平相比對(duì)側(cè)未見明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖1E。坐骨神經(jīng)阻滯組大鼠后足切割后1 h、6 h、1 d，切割側(cè)腰段脊髓背角中BDNF水平相比全麻組切割側(cè)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 后足切割后腰段脊髓背角中BDNF反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞比例

表1 后足切割后腰段脊髓背角中BDNF反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞比例

注：與對(duì)側(cè)比較，*P＜0.05。

?

圖1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)BDNF的表達(dá)

3 討論

本期實(shí)驗(yàn)證實(shí)，大鼠后足切割后同側(cè)腰段脊髓背角中BDNF水平升高，而坐骨神經(jīng)阻滯后進(jìn)行大鼠后足切割，同側(cè)腰髓背角中BDNF水平并不升高。說(shuō)明坐骨神經(jīng)阻滯能抑制后足切割引起的腰段脊髓背角中BDNF水平上升。

既往研究都發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是炎癥刺激還是切割損傷，都會(huì)導(dǎo)致?lián)p傷區(qū)域投射的脊髓背角中BDNF水平升高，其他區(qū)域BDNF水平并無(wú)改變。此BDNF升高定位于神經(jīng)元而非膠質(zhì)細(xì)胞。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，全麻下大鼠后足切割后1 h，同側(cè)腰段脊髓背角中BDNF表達(dá)即明顯增加，6 h達(dá)到峰值，并持續(xù)1 d[4]。由此推斷，脊髓背角中BDNF的迅速上升可能與周圍組織損傷、炎癥刺激產(chǎn)生的軸突動(dòng)作電位有關(guān)。

公認(rèn)的是，切割引發(fā)的動(dòng)作電位經(jīng)過脊髓背角逐級(jí)上傳，最終達(dá)到大腦皮層。而切割結(jié)束后脊髓背角檢測(cè)到的自發(fā)性放電持續(xù)時(shí)間說(shuō)法不一。有文獻(xiàn)證實(shí)大鼠切割后足結(jié)束后脊髓檢測(cè)到的自發(fā)性放電持續(xù)約30 min[7]。另有文獻(xiàn)觀察到單純皮膚切割后沒有檢測(cè)到自發(fā)性放電，而深及深層組織的后足切割1 d時(shí)，自發(fā)性放電仍很活躍[8-9]。應(yīng)用2%利多卡因0.15 ml坐骨神經(jīng)阻滯，后足癱瘓時(shí)間約為50 min，感覺喪失持續(xù)2 h以上。結(jié)合臨床中神經(jīng)阻滯麻醉的維持時(shí)間，我們有理由相信，本實(shí)驗(yàn)中有效的坐骨神經(jīng)阻滯至少能阻斷2 h的動(dòng)作電位傳導(dǎo)。鑒于應(yīng)用芬太尼會(huì)抑制大鼠脊髓中BDNF上升，全麻組我們采用單純異氟醚麻醉大鼠且控制于較低濃度。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，全麻組大鼠切割側(cè)腰段脊髓背角中BDNF水平顯著上升，坐骨神經(jīng)阻滯組大鼠后足切割后脊髓背角中BDNF水平不上升。盡管2%利多卡因坐骨神經(jīng)阻滯2 h后效果已經(jīng)明顯消退，可以認(rèn)為6 h后基本沒有阻滯效果，但切割6 h、1 d時(shí)大鼠脊髓中BDNF水平仍然不上升。似乎可以認(rèn)為切割時(shí)的產(chǎn)生的動(dòng)作電位有助于神經(jīng)系統(tǒng)BDNF的運(yùn)輸、再分布與合成，從而檢測(cè)到脊髓背角BDNF水平上升。因此阻斷了動(dòng)作電位，即很大程度影響了BDNF的運(yùn)輸、再分布與合成，從而抑制了脊髓背角中BDNF的上升。切割手術(shù)的圍術(shù)期動(dòng)作電位集中在切割手術(shù)期，其次為術(shù)后短暫的自發(fā)性電活動(dòng)(SA)。因此2%利多卡因坐骨神經(jīng)阻滯才可能對(duì)此產(chǎn)生顯著影響。而對(duì)于如注射CFA導(dǎo)致的炎性疼痛，其動(dòng)作電位峰值后延，效果既未可知。

盡管脊髓背角中BDNF水平與切割痛覺密切相關(guān)[10]，但神經(jīng)修復(fù)再生、傷口愈合亦依賴于BDNF的幫助[11]，因此臨床中分別采用全麻或神經(jīng)阻滯對(duì)于患者神經(jīng)功能恢復(fù)是否存在不同影響需要進(jìn)一步探討。

總之，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，坐骨神經(jīng)阻滯能顯著抑制各時(shí)點(diǎn)大鼠后足切割引起的腰段脊髓背角中腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)上升。

[1]Kerr BJ,Bradbury EJ,Bennett DL,et al.Brain-derived neurotrophic factor modulates nociceptive sensory inputs and NMDA-evoked responses in the rat spinal cord[J].Neurosci,1999,19:5138-5148.

[2]Thompson SW,Bennett DL,Kerr BJ,et al.Brain-derived neurotrophic factor is an endogenous modulator of nociceptive responses in the spinal cord.Proc[J].NatlAcad Sci USA,1999,96:7714-7718.

[3]Matayoshi S,Jiang N,Katafuchi T,et al.Actions of brain-derived neurotrophic factor on spinal nociceptive transmission during inflammation in the rat[J].Physiol,2005,569:685-695.

[4]張慧君,李昌琪,徐軍美,等.大鼠后足切割后脊髓和背根神經(jīng)節(jié)中腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)的變化[J].臨床麻醉學(xué)雜志,2011,27 (12):1222-1224.

[5]Zahn PK,Brennan TJ.Lack of effect of intrathecally administered N-methyl-D-aspartate receptor antagonists in a rat model for postoperative pain[J].Anesthesiology,1998,88:143-156.

[6]Zhou XF,Chie ET,Deng YS,et al.Injured primary sensory neurons switch phenotype for brain-derived neurotrophic factor in the rat [J].Neuroscience,1999,92(3):841-853.

[7]Kawamata M,Narimatsu E,Kozuka Y,et al.Effects of halothane and lsoflurane on hyperexcitability of spinal dorsal horn neurons after incision in the rat[J].Anesthesiology,2005,102(1):165-174.

[8]Douglas G,Ririe,Baogang L,et al.Electrophysiologic characteristics of large neurons in dorsal root ganglia during development and after hindpaw incision in the rat[J].Anesthesiology,2008,109(1): 111-117.

[9]Xu J,Timothy J,Brennan TJ.Guarding pain and spontaneous activity of nociceptors afterskin versus skin plus deep tissue incision[J]. Anesthesiology,2010,112(1):153-164.

[10]巴迎春,段艷萍,王金德,等.內(nèi)源性BDNF促進(jìn)受損神經(jīng)系統(tǒng)再生的實(shí)驗(yàn)研究[J].四川大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2009,40(3):418-421.

[11]張慧君,徐軍美,戴茹萍.鞘內(nèi)注射抗腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子血清對(duì)大鼠后足切割痛閾的影響[J].海南醫(yī)學(xué),2010,21(21):16-18.

Effect of sciatic nerve block on brain derived neurotrophic factor(BDNF)in the spinal cord following hindpaw incision in rats.

ZHANG Hui-jun1,WAN Pei-ling2*,WANG Ying1.

Department of Anesthesiology1,Department of Pharmacy2,People's Hospital of Hainan Province,Haikou 570311,Hainan,CHINA

ObjectiveTo investigate the effect of sciatic nerve block on the level of brain derived neurotrophic factor(BDNF)in the spinal cord following hindpaw incision in rats.MethodsThirty-two male S-D rats weighing 150～250 g were randomly divided into two groups,with 16 rats in each group.The rats in Group A were hind-paw incised following sciatic nerve block,and those in group B were hindpaw-incised under general anesthesia. Four rats in each group were randomly selected and sacrificed 1 h,6 h,1 d,3 d after the operation.The levels of BDNF were detected in their spinal cord.ResultsIn group B,the levels of BDNF in the ipsilateral lumbar spinal cord was unregulated 1 h,6 h,1 d after hindpaw incision(P＜0.05).In group A,the levels of BDNF in the lumbar spinal cord showed no significant change during the experiment(P＞0.05).Statistically significant difference was found in the levels of BDNF in ipsilateral lumbar spinal cord 1 h,6 h,1 d after incision between the two groups.ConclusionSciatic nerve block can significantly restrain the upregulation of the levels of BDNF in the lumbar spinal cord following hindpaw incision in rats.

Brain derived neurotrophic factor(BDNF);Hindpaw incison;Pain;Rats;Spinal cord;Sciatic nerve block

R-332

A

1003—6350(2012)13—020—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2012.13.009

2012-01-20)

張慧君(1974-)吉林省蛟河市人，主治醫(yī)師，碩士。

*通訊作者：萬(wàn)培玲。angrychopsticks@163.com