榮高翔，傅 娟

（湖南工業(yè)大學(xué) 綠色包裝與生物納米技術(shù)應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 株洲 412007）

0 引言

金屬硫蛋白（metallothionein，MT）是重金屬代謝應(yīng)答反應(yīng)中一類重要的小分子蛋白。根據(jù)等電點(diǎn)和氨基酸組成的不同，發(fā)現(xiàn)MT基因在哺乳動(dòng)物中至少有MT-1，MT-2，MT-3和MT-4等4種主要形式[1]。其中MT-1和MT-2基因表達(dá)范圍最廣，幾乎存在于哺乳動(dòng)物的所有器官或組織中，尤以肝、腎細(xì)胞為主，而且主要被鎘特異性誘導(dǎo)[2-3]。在正常水平下，MT-2A基因型的表達(dá)量多于MT-1基因，約占所有金屬硫蛋白異構(gòu)體表達(dá)量的50%[4]。有報(bào)道表明，造成MT-1與MT-2A基因表達(dá)量的差異，可能與MT-2A基因啟動(dòng)子區(qū)域的增強(qiáng)子活性較強(qiáng)有關(guān)[5]。針對(duì)美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫中人類MT-2A基因已發(fā)現(xiàn)的27個(gè)單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNPs）位點(diǎn)中，核心啟動(dòng)子區(qū)域TATA盒附近-5A/G（rs 28366003）SNP位點(diǎn)備受關(guān)注。本文擬對(duì)湖南省株洲市某冶煉工作業(yè)人群外周血中MT-2基因核心啟動(dòng)子區(qū)域TATA盒附近-5A/G的SNP位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，分析該人群中基因型分布特點(diǎn)，以期為深入探討我國漢族人群MT-2A基因多態(tài)性特點(diǎn)提供一定參考，也可為進(jìn)一步探討MT-2A基因在重金屬毒性易感中的作用奠定一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

以湖南株洲某冶煉廠作業(yè)工人共288例為研究對(duì)象（均為漢族）；其中，男性176例，平均年齡為（42.52±14.20） ；女性112例，平均年齡為（38.81±12.48），在研究對(duì)象知情并同意下，各抽取外周靜脈血5 mL，經(jīng)EDTA抗凝處理后，于-80℃保存，以備基因組DNA提取。

1.2 主要材料與儀器

MT-2A基因擴(kuò)增上游引物( FP) 5’-GGG CCG CCT TCA GGG AAC TG-3’，生物素修飾的下游引物( bio-RP) 5’bio-GGA CTT GGA GGA GGC GTG GT-3’；檢測(cè)等位基因特異性的野生型熒光探針(W-probe) Cy3-CGCTGCACTCCAC和突變型熒光探針(T-probe) Cy5-CGCTGCGCTCCAC ；上述引物和探針均由上海生工生物工程有限公司標(biāo)記并合成；γ-氨基丙基三乙氧硅烷 （γ-Aminopropyltriethoxysilane，APTS）和戊二醛均購于Sigma公司；雜交液和鏈霉親合素均購于上海生工生物工程有限公司；粒徑約100 nm的SiO2/（ PMMA/Fe3O4） （polymethylmethacrylate，PMMA）磁性納米顆粒為本實(shí)驗(yàn)室自備；所有化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純；Taq DNA聚合酶、DNA marker、dNTP為Promega產(chǎn)品； 瓊脂糖購于上海生工BBI公司； PTC220型PCR擴(kuò)增儀為MJ Research公司產(chǎn)品； GenePix 4100A熒光掃描儀為美國Axon儀器公司產(chǎn)品；Nano2 Plotter型點(diǎn)樣儀為美國Affymetrix產(chǎn)品。

1.3 基因組DNA的提取與鑒定

人外周血基因組DNA提取采用改良碘化鉀方法，DNA含量和純度鑒定采用核酸蛋白定量?jī)x和瓊脂糖凝膠電泳法。具體方法是取EDTA-Na2抗凝外周血400L加至1.5 mL離心管中，加滅菌去離子水900L，10 000 r/min離心5 min，棄去上清液；在沉淀中加入5 mol/L KI溶液100 μL，旋渦振蕩使其充分溶解，靜置2 min；加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9 %的NaCl溶液300 μL，氯仿/異戊醇(24:1)750L，旋渦震蕩，充分混勻，靜置2 min；12 000 r/min 離心5 min，吸取上清液；在上清液中加入400L異丙醇，輕輕混勻，10 000 r/min 離心5 min，棄去上清液；在沉淀中加入1 000L體積分?jǐn)?shù)為70%的冰乙醇，10 000 r/min 離心5 min，棄去乙醇，在真空冷凍干燥儀中干燥；加入80L滅菌去離子水或TE，55℃水浴30 min溶解；鑒定則是取5L DNA工作液用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA片段的完整性；最后將提取的基因組DNA置于-20℃冰箱冷凍儲(chǔ)存。

1.4 磁性納米顆粒表面的引物連接

利用APTS與戊二醛在SiO2/( PMMA/Fe3O4)磁性納米顆粒表面修飾上醛基，然后取修飾醛基的磁性顆粒10 mg加入含體積分?jǐn)?shù)10%親合素的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）2.5 mL中，于37 ℃下孵育3 h。將 10mol /L生物素標(biāo)記的50L下游引物加入包被親合素的磁性納米顆粒中，室溫下孵育1 h，并將該溶液不斷振蕩混勻。反應(yīng)結(jié)束后，用外加磁場(chǎng)將顆粒從反應(yīng)介質(zhì)中分離出來，并用PBS溶液反復(fù)清洗產(chǎn)物，最后以4.0 mg/mL的質(zhì)量濃度分散在 PBS溶液中備用。

1.5 基于磁性納米顆粒表面的基因特定片段PCR擴(kuò)增及鑒定

1.6 雙色熒光雜交的微陣列SNP分型

[6]的方法進(jìn)行SNP分型檢測(cè)，即將固定有ssDNA的磁性納米顆粒反復(fù)清洗后，分別加入10 mmol/L熒光標(biāo)記探針W-probe和體積分?jǐn)?shù)T-probe各1L與雜交液混勻后于37 ℃雜交1 h，然后經(jīng)檸檬酸鈉溶液（saline sodium citrate，SSC）和體積分?jǐn)?shù)0.1%十二烷基硫酸鈉（sodiumdodecyl sulfate，SDS），反復(fù)清洗后，將其均勻地分散于15L體積分?jǐn)?shù)3%SSC緩沖液中，于95℃變性5 min，置于冰上驟冷，磁分離后吸取上清液點(diǎn)樣于干凈的載玻片上，經(jīng)熒光掃描儀掃描分析，獲得樣品分型圖像，并經(jīng)分析軟件 Genep ix 6.0分析后轉(zhuǎn)化為數(shù)據(jù)。

1.7 測(cè)序驗(yàn)證

根據(jù)磁性納米顆粒微陣列SNP分型結(jié)果，各抽取1份MT-2A基因的多態(tài)等位基因型（AA型、AG型、GG型）的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，送上海生工生物工程有限公司直接測(cè)序，以驗(yàn)證其分型的準(zhǔn)確性。

1.8 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)分析軟件包SPSS 16.0處理。應(yīng)用擬合優(yōu)度χ2檢驗(yàn)MT-2A基因型頻數(shù)是否符合Hardy-Weinberg ( H-W) 遺傳平衡定律。

2 結(jié)果

2.1 基因組DNA的鑒定

圖1為基因組DNA產(chǎn)物。如圖所示，改良KI法提取后的DNA產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，8個(gè)樣品均具有一條較清晰的泳帶，說明基因組DNA產(chǎn)物的提取合格，可以用于進(jìn)行PCR的擴(kuò)增。

圖1 基因組DNA產(chǎn)物的1%瓊脂糖電泳圖Fig.1 The 1% agarose pattern of DNA products

2.2 磁性納米顆粒介導(dǎo)的MT-2A基因PCR擴(kuò)增

圖2為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖。如圖所示，磁性納米顆粒介導(dǎo)的MT-2A基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker條帶相比，各泳道中均在約222 bp大小相對(duì)應(yīng)位置有一條清晰的亮帶，說明磁性納米顆粒表面介導(dǎo)的PCR反應(yīng)體系中能擴(kuò)增出所需的目的片段。

圖2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的2%瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 The 2% agarose gel pattern of PCR products

2.3 基于磁性納米顆粒微陣列技術(shù)的MT-2A基因SNP分型

圖3為PCR產(chǎn)物的熒光信號(hào)掃描圖。如圖所示，經(jīng)熒光掃描儀檢測(cè)獲得雙色熒光雜交微陣列芯片中SNP分型信號(hào)呈現(xiàn)的綠色、黃色和紅色分別代表隨機(jī)6個(gè)樣品在MT-2A基因rs28366003位點(diǎn)的3種基因型。其中樣品S1，S2，S3的綠色信號(hào)代表AA基因型；樣品S4，S5的黃色信號(hào)代表AG基因型；樣品S6的紅色信號(hào)代表GG基因型。雖然不同的樣品具有不同的熒光強(qiáng)度，但該分型結(jié)果均具有較高的正錯(cuò)配信號(hào)比。

圖3 M-2A基因rs28366003位點(diǎn)SNP分型熒光信號(hào)掃描圖Fig.3 The fluorescence signal scanning of MT-2A gene rs28366003 site SNP genotyping

2.4 直接測(cè)序驗(yàn)證

針對(duì)基于磁性納米顆粒微陣列技術(shù)的MT-2A基因SNP分型檢測(cè)結(jié)果，選取S1, S4, S6進(jìn)行直接PCR產(chǎn)物的測(cè)序，結(jié)果如圖4所示。在MT-2A基因rs28366003位點(diǎn)處（方框標(biāo)注處），樣品S1只檢測(cè)到單一的A峰，顯示其為AA基因型；樣品S4在該處同時(shí)檢測(cè)到A峰和G峰，顯示其為AG基因型；而樣品S6只檢測(cè)到單一的G峰，表明其為GG基因型。其測(cè)序結(jié)果與基于磁性納米顆粒微陣列技術(shù)的MT-2A基因SNP分型結(jié)果完全一致。

圖4 樣品S1, S4, S6測(cè)序圖Fig.4 The sequencing graph of sample S1,S4 and S6

2.5 MT-2A基因型和等位基因頻率分析

MT-2A基因型和等位基因頻率分析如表1所示，288個(gè)樣品的基因型（AA型, AG型和GG型）頻率分別為87.4%, 11.8%和0.8%。其等位基因A和G的頻率分別為93.3%和6.7%。經(jīng)擬合優(yōu)度χ2檢驗(yàn)，該人群MT-2A基因型與等位基因頻率均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡（p>0.05）。

表 1MT-2A基因基因型和等位基因頻率分布Table1 The distribution of genotype and allele frequencies of MT-2A gene

3 結(jié)語

MT基因是機(jī)體內(nèi)重金屬應(yīng)答反應(yīng)中的一類重要基因，在機(jī)體中的表達(dá)水平可反映該基因的應(yīng)答功能。而基因表達(dá)主要由核心啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件和TATA盒決定。金屬硫蛋白的核心啟動(dòng)子區(qū)域包括金屬反應(yīng)元件（MREs）、糖皮質(zhì)反應(yīng)元件（GRE）、抗氧化反應(yīng)元件（ARE）、環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件（cAMP）、組織纖維蛋白溶酶原激活劑（TPA）反應(yīng)元件和干擾素反應(yīng)元件。在人體MT-2A基因上游區(qū)域中，至今發(fā)現(xiàn)了7個(gè)金屬反應(yīng)元件（MREa to MREg）。在TATA盒附近，金屬轉(zhuǎn)錄因子（MTF-1）激活金屬硫蛋白啟動(dòng)子區(qū)域的金屬反應(yīng)元件（MREs）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。當(dāng)人體暴露于金屬或氧化壓力下時(shí)，金屬轉(zhuǎn)錄因子便會(huì)被激活并實(shí)現(xiàn)上述金屬反應(yīng)元件的轉(zhuǎn)錄。而MT基因的轉(zhuǎn)錄需要MER進(jìn)行調(diào)控。相較于其他普通區(qū)域的基因，位于核心啟動(dòng)子區(qū)域，特別是在TATA盒附近的基因發(fā)生突變將使目的基因的表達(dá)產(chǎn)生更大的影響，會(huì)降低MTF-1結(jié)合MREs的親和力，并減少金屬硫蛋白基因的轉(zhuǎn)錄[7]。K. Kita等研究發(fā)現(xiàn)人群MT-2A基因啟動(dòng)子區(qū)域-5A/G的SNP分型與體內(nèi)MT-2A基因的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)減少密切相關(guān)[8]。因此，本文研究MT基因核心啟動(dòng)子區(qū)域的多態(tài)性分布特點(diǎn)具有重要意義。

本研究通過應(yīng)用基于磁性納米顆粒微陣列技術(shù)對(duì)MT-2A基因rs28366003位點(diǎn)進(jìn)行SNP分型具有高效、簡(jiǎn)單和廉價(jià)的特點(diǎn)。隨機(jī)選取的288例冶煉作業(yè)工人血液樣本中，大多數(shù)個(gè)體具有AA基因型，為251例；AG基因型為34例，GG基因型為3例。經(jīng)檢驗(yàn)，該人群MT-2A基因型與等位基因頻率均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。有研究報(bào)道，GG基因型個(gè)體比AA基因型個(gè)體有較低含量的鋅和較高的鎘與鉛，推測(cè)GG基因型個(gè)體可能對(duì)重金屬毒性易感[9]。本研究初步探討冶煉作業(yè)人群中MT-2A基因核心啟動(dòng)子區(qū)域SNP分型分布特點(diǎn)，對(duì)深入大規(guī)模研究我國重金屬暴露人群的MT-2A基因功能具有重要意義。關(guān)于MT-2A基因的SNP位點(diǎn)與重金屬毒性易感是否存在關(guān)聯(lián)有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] Miles A T, Hawksworth G M, Beattie J H， et al. Induction,Regulation, Degradation, and Biological Significance of Mammalian Metallothioneins[J]. Crit. Rev. Biochem. Mol.Biol., 2000，35(1)：35-70.

[2] Cherian M G, Jayasurya A, Bay B H. Metallothioneins in Human Tumors and Potential Roles in Carcinogenesis[J].Mutat. Res., 2003，533(1/2)：201-209.

[3]Wolff N A, Lee W K, Abouhamed M，et al. Role of ARF6 in Internalization of Metal-Binding Proteins, Metallothionein and Transferring, and Cadmium-Metallothionein Toxicity in Kidney Proximal Tubule Cells[J]. Toxicol Appl Pharmacol，2008，230(1)：78-85.

[4]Skroch P, Buchman C, Karin M. Regulation of Human and Yeast Metallothionein Gene Transcription by Heavy Metal Ions[J]. Prog. Clin. Biol. Res., 1993，380：113-128.

[5] Samson SL, Gedamu L. Molecular Analyses of Metallothionein Gene Regulation[J]. Prog. Nucleic Acid Res.Mol. Biol., 1998，59：257-288.

[6] 劉洪娜，李 松，王志飛，等. 一種基于磁性納米粒子PCR的高通量SNP分型方法[J]. 高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)，2007，28 (6)：1035-1038.Liu Hongna，Li Song，Wang Zhifei，et al. High-Throughput SNP Genotyping Method with PCR on Magnetic Nanoparticles[J]. ChemicalJournal of Chinese Universities，2007，28 (6)：1035-1038.

[7] Koizumi S, Suzuki K, Ogra Y，et al. Transcriptional Activity and Regulatory Protein Binding of Metal-Responsive Elements of the Human Metallothionein-IIA Gene[J]. Eur.J. Biochem，1999，259(3)：635-42.

[8] Kita K, Miura N, Yoshida M, et al. Potential Effect on Cellular Response to Cadmium of a Single-Nucleotide A→G Polymorphism in the Promoter of the Human Gene for Metallothionein IIA[J]. Hum. Genet., 2006, 120：533-560.

[9] Kayaalti Z，Mergen G，SylemezoluT. Effect of Metallothionein Core Promoter Region Polymorphism on Cadmium, Zinc and Copper Levels in Autopsy Kidney Tissues from a Turkish Population[J]. Toxicol App Pharmacol，2010，245(2)：252-255.