劉婷婷，朱文增，金 弘，黃日龍

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱150040;2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京100053; 3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江哈爾濱150040;4.安徽省中醫(yī)院，安徽合肥230031)

頭穴叢刺法對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦組織AQP4表達(dá)的影響*

劉婷婷1，朱文增2△，金 弘3，黃日龍4

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱150040;2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京100053; 3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江哈爾濱150040;4.安徽省中醫(yī)院，安徽合肥230031)

目的:研究頭穴叢刺法對(duì)腦缺血再灌注大鼠的腦保護(hù)作用機(jī)制。方法:采用改良的線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型。將Wistar雄性大鼠，隨機(jī)分成3組:假手術(shù)組、模型組、頭穴叢刺組。各組隨機(jī)分成6 h、1 d、2 d、3 d共5個(gè)時(shí)間點(diǎn)，采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)大鼠腦缺血再灌注后AQP4蛋白表達(dá)變化及頭穴叢刺法治療對(duì)它們的影響。結(jié)果:免疫組化結(jié)果顯示與模型組比較，頭穴叢刺組損傷側(cè)腦組織AQP4蛋白表達(dá)水平明顯升高(P＜0.05或P＜0.01)。結(jié)論:頭穴叢刺法能夠調(diào)節(jié)AQP4的表達(dá)，減輕由于再灌注損傷導(dǎo)致的血腦屏障通透性增強(qiáng)，從而減輕腦水腫，在腦缺血再灌注早期起到挽救和保護(hù)受損神經(jīng)元、改善神經(jīng)功能的治療作用。

腦缺血再灌注;頭穴叢刺法;腦水腫;水通道蛋白－4

缺血性腦血管病以其高發(fā)病率、高致殘率和高死亡率嚴(yán)重影響著人們的健康?；謴?fù)缺血腦組織的血流灌注是治療腦缺血的前提，但再灌注過程中會(huì)繼發(fā)多種腦組織損傷。經(jīng)過多年的研究，針刺在治療腦缺血急性期和后遺癥神經(jīng)元保護(hù)方面取得了重要進(jìn)展，頭穴叢刺法治療在臨床上取得極好的療效。本研究擬從分子水平探討頭穴叢刺法對(duì)腦缺血再灌注損傷后血腦屏障功能恢復(fù)和腦水腫的防治機(jī)制，證實(shí)頭穴叢刺法在改善神經(jīng)功能、促進(jìn)神經(jīng)再生、血腦屏障修復(fù)和功能重建等方面的優(yōu)勢(shì)，為臨床上進(jìn)一步采用頭穴叢刺法治療腦梗死提供客觀依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

雄性清潔級(jí)Wistar大鼠180只，體質(zhì)量(250± 20)g，鼠齡4～5個(gè)月，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào):黑動(dòng)字第P00102008)。大鼠自由進(jìn)食、飲水，同等條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，手術(shù)前12 h禁食不禁水。按隨機(jī)數(shù)字表法將動(dòng)物隨機(jī)分成3組:假手術(shù)組、缺血再灌注模型組(以下簡(jiǎn)稱模型組)、缺血再灌注后頭穴叢刺治療組(以下簡(jiǎn)稱頭針組)。各組隨機(jī)分成6 h、1 d、2 d、3 d、5 d共5個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)12只動(dòng)物。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模型制備

采用改良的Zea Longa法［1，2］制作右側(cè)大腦中動(dòng)脈阻塞(腦缺血)再灌注模型。

栓線制備［3］:把直徑0.234 mm的日本產(chǎn)釣魚用尼龍線(日本漁具株式會(huì)社)切割成長(zhǎng)約5.0 cm的小線段，將其一端快速閃過火焰燒制成光滑球形，選用表面光滑、斷面平直及球體直徑約為0.25 mm的線栓，在離球端3 cm處標(biāo)記，75%酒精清潔處理，浸泡于125 mg/dl肝素生理鹽水中，置于4℃冰箱內(nèi)備用。

模型制備過程:10%水合氯醛35 mg/kg腹腔麻醉，頸部正中切口，自胸骨角到距離鼠下唇1.0 cm處，剝離暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈1～1.5 cm，近心端絲線結(jié)扎，并結(jié)扎右側(cè)頸外動(dòng)脈。頸總動(dòng)脈切口，栓線插入18～20 mm，將栓線經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈送至大腦中動(dòng)脈起始處，逐層縫合。腦缺血2 h后，輕輕回撤栓線，實(shí)現(xiàn)腦缺血再灌注。術(shù)中及術(shù)后維持動(dòng)物肛溫在(37±1)℃，術(shù)后分籠飼養(yǎng)，自由飲食飲水。

1.2.2 取穴及針刺方法

參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》［4］取大鼠的百會(huì)穴和百會(huì)穴左右旁開2 mm共3個(gè)穴位。

假手術(shù)組:手術(shù)時(shí)把尼龍栓線僅插入頸總動(dòng)脈6 mm左右而不入顱;術(shù)后不給予任何治療。

模型組:造模后，不給予任何治療。

頭針組:待動(dòng)物評(píng)分后開始給予頭穴叢刺治療，每日針刺1次，用0.35 mm×25 mm毫針從后向前平刺大約6～8 mm，每次留針30 min，每15 min捻針1次，頻率為200轉(zhuǎn)/min左右，每次持續(xù)捻轉(zhuǎn)3 min。

1.3 觀察項(xiàng)目及方法

1.3.1 動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)體征的觀察與評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

參照Z(yǔ)ea Longa的5級(jí)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［1］，所有動(dòng)物再灌注完成后6 h，進(jìn)行第1次神經(jīng)功能缺損評(píng)分，以后分別于再灌注后1 d、2 d、3 d、5 d時(shí)進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。0分:無(wú)神經(jīng)缺損癥狀，活動(dòng)正常;1分:不能完全伸展左側(cè)前肢，輕度局灶性神經(jīng)功能缺失;2分:行走時(shí)身體向左側(cè)轉(zhuǎn)圈，中度局灶性神經(jīng)功能缺失;3分:行走時(shí)身體向左側(cè)傾倒，重度局灶性神經(jīng)功能缺失;4分:不能自發(fā)行走，意識(shí)水平喪失。

造模后對(duì)其進(jìn)行初選，保留神經(jīng)功能評(píng)分在1～3分的大鼠。造模及針刺過程中死亡的大鼠予以剔除，按隨機(jī)數(shù)字表補(bǔ)入。密切觀察造模大鼠的各項(xiàng)體征，詳細(xì)記錄。

1.3.2 免疫組化法檢測(cè)AQP4蛋白的表達(dá)

AQP4在星形膠質(zhì)細(xì)胞及血管周圍呈棕黃色為陽(yáng)性表達(dá)。免疫組化染色切片圖像結(jié)果分析方法:采用Motic Med6.0圖像分析系統(tǒng)，每組選6張切片，利用顯微攝像系統(tǒng)，每張切片在400倍下隨機(jī)選取缺血區(qū)5個(gè)非重疊視野，AQP4計(jì)算陽(yáng)性顯色的面積百分比，取其平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分比較

見表1。模型組在2 d時(shí)神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著高于6 h、1 d(P=0.001，0.041＜0.05)，隨后開始下降，在5 d時(shí)明顯優(yōu)于2 d評(píng)分，具有顯著性差異(P= 0.001＜0.05)，但與3 d、6 h差異不顯著?？梢娫谌毖俟嘧? h～2 d，神經(jīng)功能缺損有所加重，隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)，模型組大鼠神經(jīng)功能缺損在一定程度上存在著自發(fā)性恢復(fù)的趨勢(shì)。頭針組在3 d時(shí)神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯減少，與2 d、1 d時(shí)比較，具有顯著性差異(P=0.001，0.047＜0.05)，但與6 h比較，無(wú)顯著性差異(P=0.370＞0.05)，至5 d時(shí)評(píng)分減少程度更明顯，分別優(yōu)于6 h、1 d、2 d、3 d(P=0.003，0.001，0.001，0.001＜0.05)。

與假手術(shù)組比較，大鼠腦缺血再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)模型組、頭針組均出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能缺損，兩兩比較具有顯著性差異(P＜0.05);頭針組在術(shù)后6 h、1 d、2 d與模型組比較無(wú)顯著性差異(P=0.294，0.533，0.264＞0.05)，3 d、5 d時(shí)均可見神經(jīng)功能缺損評(píng)分減少，頭針組明顯優(yōu)于模型組，具有顯著性差異(P=0.003，0.001＜0.05)。說明頭穴叢刺法能夠促進(jìn)腦缺血大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)，減輕神經(jīng)功能缺損癥狀。

2.2 頭穴叢刺法對(duì)腦缺血再灌注大鼠缺血側(cè)腦組織AQP4表達(dá)的影響

見表2。假手術(shù)組大鼠AQP4主要在皮層、皮層下白質(zhì)及紋狀體區(qū)的毛細(xì)血管壁、膠質(zhì)細(xì)胞的胞膜表達(dá)，而在神經(jīng)元?jiǎng)t未見表達(dá)。模型組AQP4表達(dá)隨時(shí)間的推移而發(fā)生一定變化，在1 d時(shí)降至最低，隨后逐漸回升，個(gè)別大鼠在海馬錐體細(xì)胞層出現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)。頭針組也可見AQP4表達(dá)，與假手術(shù)組較為接近。

模型組在6 h缺血側(cè)腦組織中AQP4表達(dá)有所下降，1 d時(shí)缺血側(cè)腦組織中AQP4表達(dá)降至最低，與6 h時(shí)比較，具有顯著性差異(P=0.001＜0.05);從2 d開始逐漸恢復(fù)，3 d時(shí)腦組織中AQP4表達(dá)明顯高于1 d (P=0.001＜0.05);5 d時(shí)腦組織中AQP4表達(dá)繼續(xù)回升，接近正常數(shù)值，但顯著高于1 d(P=0.001＜0.05)，且與3 d相比，有顯著性差異(P=0.001＜0.05)。

與假手術(shù)組比較，大鼠腦缺血再灌注后6 h、1 d、2 d、3 d模型組AQP4表達(dá)均出現(xiàn)不同程度的改變，兩兩比較具有顯著性差異(P＜0.05);頭針組在再灌注后6 h與模型組比較無(wú)顯著性差異(P=0.275＞0.05)，1 d、2 d、3 d、5 d時(shí)頭針組AQP4表達(dá)雖有明顯回升，但1 d、2 d、3 d、5 d時(shí)AQP4表達(dá)明顯低于同時(shí)間點(diǎn)模型組，具有顯著性差異(P=0.035，0.049，0.007，0.001＜0.05)。

表1 實(shí)驗(yàn)各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分 (±s)

表1 實(shí)驗(yàn)各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分 (±s)

注:與假手術(shù)組比較，*P＜0.05;與模型組比較，△P＜0.05，▲P＜0.01。

6 h 1 d 2 d 3 d 5 d假手術(shù)組組別 例數(shù)120 0 0 0 0模型組 12 1.83±0.49*2.29±0.39*2.67±0.33*2.25±0.40*1.96±0.54*頭針組 12 1.67±0.44*2.21±0.40*2.54±0.33*1.83±0.39＊△1.08±0.63＊▲

表2 頭穴叢刺法對(duì)腦缺血再灌注大鼠缺血側(cè)腦組織AQP4表達(dá)的影響 (%，±s)

表2 頭穴叢刺法對(duì)腦缺血再灌注大鼠缺血側(cè)腦組織AQP4表達(dá)的影響 (%，±s)

注:與假手術(shù)組比較，*P＜0.05;與模型組比較，△P＜0.05，▲P＜0.01。

6 h 1 d 2 d 3 d 5 d假手術(shù)組 6 7.43±0.54 7.53±0.44 7.55±0.59 7.57±0.62 7.組別 n 51±0.65模型組 6 5.56±0.56*3.89±0.55*4.33±0.42*5.94±0.63*7.35±0.53頭針組 6 5.40±0.54*3.61±0.53＊△4.08±0.40＊△5.53±0.49＊▲5.71±0.47＊▲

3 討論

近年來研究發(fā)現(xiàn)，水通道蛋白(aquaporin，AQP)家族中的AQP4可介導(dǎo)水跨膜的雙向運(yùn)動(dòng)，參與血漿滲透壓的調(diào)節(jié)、血腦屏障的發(fā)育和功能維系，并兼有細(xì)胞外滲透壓感受器的功能，對(duì)維持腦內(nèi)水平衡至關(guān)重要，與腦水腫有著密切的關(guān)系［5～6］。

本研究發(fā)現(xiàn)的AQP4水平或活性主動(dòng)降低正是機(jī)體從微觀上對(duì)腦水腫和血腦屏障損傷的一種保護(hù)性反應(yīng)。其可能的作用機(jī)制是:缺血再灌注損傷后，細(xì)胞間隙中增高的K+、H+以及以谷氨酰胺為首的一系列興奮性氨基酸濃度上升，由此刺激膠質(zhì)細(xì)胞啟動(dòng)激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)［7］，并導(dǎo)致蛋白激酶 C活性升高［8］，激活的蛋白激酶C對(duì)AQP4進(jìn)行磷酸化反應(yīng)，AQP4經(jīng)磷酸化后其生物活性喪失［9～11］，從而在一定程度上減少經(jīng)由破壞的血腦屏障進(jìn)入腦組織細(xì)胞間隙以及經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的水分子的量，從而達(dá)到減緩腦水腫的目的。但是當(dāng)局部區(qū)域的各種有害物質(zhì)逐漸增多，細(xì)胞外間隙中的H+、Na+、K+、Cl－、興奮性氨基酸濃度繼續(xù)升高到一定水平時(shí)，這時(shí)膠質(zhì)細(xì)胞將對(duì)此作出另一方向的調(diào)節(jié)以緩沖正在急劇惡化的細(xì)胞外液環(huán)境，這時(shí)的膠質(zhì)細(xì)胞在增加清除K+的同時(shí)，將通過提高包括AQP4在內(nèi)的多種AQPs表達(dá)水平和活性［12］，以增加遭受破壞的血腦屏障對(duì)水分子的通透，增加細(xì)胞外間隙水含量，從而降低細(xì)胞外液中有害物質(zhì)的濃度，達(dá)到進(jìn)一步保護(hù)神經(jīng)元功能的目的。已有證據(jù)［13］提示腦組織中AQP4可能調(diào)節(jié)腦脊液的形成及細(xì)胞外液的容積的變化。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)AQP4與腦缺血性腦水腫的形成有關(guān)。與近年來國(guó)內(nèi)外的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床觀察的研究結(jié)果一致［14～15］。

本課題是針灸專家于致順教授頭穴叢刺系統(tǒng)研究的總結(jié)與深化，其可能的作用機(jī)制是:在頭部相應(yīng)治療區(qū)進(jìn)行“叢式”針刺，間斷行針，針刺每一穴位后，在所針刺穴位處產(chǎn)生了一定的生物磁場(chǎng)，多個(gè)場(chǎng)相互作用并增強(qiáng)場(chǎng)的效應(yīng)，通過傳導(dǎo)系統(tǒng)(經(jīng)絡(luò)、神經(jīng))作用于人體相應(yīng)的部位，增強(qiáng)對(duì)身體相應(yīng)部位的作用。這種生物磁場(chǎng)還可以直接的穿透高阻抗的顱骨作用于大腦皮層，改善腦血流，促進(jìn)水液循環(huán)及物質(zhì)代謝，從而利于水腫的消除，并能產(chǎn)生相應(yīng)的神經(jīng)沖動(dòng)，改善神經(jīng)沖動(dòng)的傳導(dǎo)，促進(jìn)神經(jīng)恢復(fù)。這樣的針刺方法從針刺部位上來說，使對(duì)頭部的刺激由原來點(diǎn)狀刺激或線狀刺激擴(kuò)展到了面狀刺激，增加了針刺的刺激面積［16～17］，同時(shí)也增加了刺激量，從而體現(xiàn)出頭穴叢刺法相比于其它頭針療法的治療優(yōu)勢(shì)。

［1］ Zea Longa E，Weinsten PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1999，20 (1):84－91

［2］ Nagasawa H.Correlation between cerebral blood and histologic changes in a new rat model of cerebral artery occlusion［J］.Stroke，1999，20:1037

［3］ 關(guān)云謙，陳彪，周茗鄒，等.尼龍線直徑和硬度對(duì)大鼠線栓法腦缺血模型成功率的影響［J］.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，26(5):600

［4］ 李忠仁.實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)［M］.北京:中國(guó)中醫(yī)藥出版社，2003:327－328

［5］ Tang Y，Wu P，Su J，et al.Effects of Aquaporin－4 on edema formation following intracerebral hemorrhage［J］.Exp Neurol，2010，223 (2):485－495

［6］ Noell S，F(xiàn)allier－Becker P，BeyerC，et al.Effects of agrin on the expression and distribution of the water channelprotein aquaporin－4 and volume regulation in cultur－ed astrocytes［J］.Eur J Neurosc，2007，26:2109－2118

［7］ Siesjo BK.Pathophysiology and treatment of focal cerebral ischemia: PartⅡ－mechanisms of damage and treatment［J］.Neurosurg，1992，77:337－354

［8］ Kurkinen K，Keinanen R，Li W，et al.Preconditioning with spreading depression activates specifically protein kinase C delta［J］.Neuro Report，2001，21:269－271

［9］ Han Z，Wax MB，Patil RV.Regulation of aquaporin－4 water channel by phorbolester－dependent protein phosphorylation［J］.Biol Chem，1998，273:6001－6004

［10］ Yamamoto N，Sobue K，Miyaehi T，et al.Differential regulation of aquaporin expression in astrocytes by protein kinase C［J］.Mol Brain Res，2001，95:110－116

［11］ Park JH，Okayama N，Gute D，et al.Hypoxia/aglycemia increases endothelial permeability:Role of second messengers and cytoskeleton［J］.Am J Physiol，1999，277:C1066－C1074

［12］ 楊曉波，宋水江.水通道蛋白－4與腦水腫［J］.國(guó)際腦血管病雜志，2006，14(6):448－451

［13］ 趙應(yīng)敏，宋波，許予明.AQP4與腦水腫［J］.臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2007，6(5):164－165

［14］ Zhou J，KongH，HuaX，et al.Altered blood brain barrier integrity in a dult aquaporin－4 knockoutmice［J］.Neuroreport，2008，19(1):1－5

［15］ 郭富強(qiáng)，徐玉川，陳隆益，等.腦出血患者血腫周圍組織水通道蛋白－4表達(dá)與腦水腫及病理超微結(jié)構(gòu)變化的關(guān)系［J］.中國(guó)危重病急救醫(yī)學(xué)，2008，20:674－677

［16］ 王薇.于致順教授治療中風(fēng)選穴的經(jīng)驗(yàn)［J］.針灸臨床雜志，1993 (9):3

［17］ 馬松濤.頭針治療中風(fēng)偏癱的臨床觀察［J］.河北中醫(yī)，1993，15(1):28

The Effect of Cluster Acupuncture on Scalp Points on AQP4Expression in Cerebral Ischemica Reperfusion Rats

LIU Ting－ting1，ZHU Wen－zeng2△，JIN Hong3，HUANG Ri－long4
(1.Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China; 2.Guang＇anmen Hospital，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100053，China; 3.The First Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150040，China; 4.Anhui Provincial Hospital of Chinese Medicine，Hefei 230031，China)

Objective:To explore cerebral protection mechanism of cluster acupuncture on scalp points (CASP)in cerebral ischemia reperfusion(CIR)rats.Methods:Focal cerebral ischemia was induced by intraluminal middle cerebral artery occlusion(MCAO)method using a monofilament thread in rats.Male Wistar rats were divided randomly into three groups:sham group、model group、and CASP group;each group was separated into 6 h，l d，2 d，3 d，5 d after reperfusion as subgroup for investigation.The expression of AQP4protein in CIR rats were measured by immunohistochemical method and the influence of the expression by CASP was observed.Results:Immunohistochemistry results indicated that compared with model group，the expression of AQP4has been significantly increased in CASP group(P＜0.05，P＜0.01).Conclusion:CASP method can regulate AQP4expression to reduce BBB permeability to prevent cerebral edema，through reducing cerebral edema，CASP method can save and protect damaged neurons，improve nervous function at early stage of CIR.

Cerebral ischemia reperfusion;Cluster acupuncture on scalp points(CASP);Cerebral edema; AQP4

R246.1

A

1005－0779(2012)008－0055－03

2012－01－15

黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目，編號(hào):2006D－61。

劉婷婷(1979－)，女，講師，主要研究方向:針刺治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究。

△通訊作者:朱文增(1971－)，男，副主任醫(yī)師，主要研究方向:頭針防治中風(fēng)和中醫(yī)臨床評(píng)價(jià)。