羅洲飛，劉妮娜，徐彥軍，饒力群

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學生物科學技術(shù)學院，湖南 長沙 410128；2.中國科學院植物研究所北京植物園，北京 100093；3.中國農(nóng)業(yè)大學理學院，北京 100193；4.中國科學院研究生院，北京 100049）

扁蕾（Herba Gentianopsis）為龍膽科植物扁蕾Gentianopsis barbata（Froel.）Ma 的全草，主要生長在高海拔的河灘、山坡草地及林緣地區(qū)，在我國主要分布于西南、內(nèi)蒙古、河北、東北等地[1]。扁蕾在治療急性黃疸型肝炎、結(jié)膜炎、高血壓、急性腎盂腎炎、瘡癤腫毒、慢性肺源性心臟病等有廣泛的應用[2-3]。大興安嶺地區(qū)的扁蕾產(chǎn)量極少，民間藥用價值很高，已作為一種傳統(tǒng)蒙藥植物被廣泛運用，但其化學成分尚未見報道。為進一步研究其藥效成分，筆者對產(chǎn)于大興安嶺地區(qū)的扁蕾進行了化學成分的初步研究，并比較了不同部位的化學組成差異。李作平等[4]用色譜法和光譜法對扁蕾的化學成分進行了分析，其中主要成分為口山酮類。文章利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HPLC-ESI-MSn）分離鑒定大興安嶺地區(qū)的野生扁蕾不同部位的口山酮類化學成分，為該藥材的品質(zhì)評價和開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

1.1.1 供試材料 自然干燥的野生扁蕾全草，于2011年采自大興安嶺漠河（經(jīng)度：124°07′ E，緯度：53°42′ N，海拔高度：576 m），經(jīng)黑龍江大興安嶺地區(qū)農(nóng)業(yè)林業(yè)科學院鑒定為龍膽科植物扁蕾，標本保存于中科院植物所植物園。

1.1.2 試 劑 乙腈和甲醇（色譜純）購于北京先明樂施科技發(fā)展有限公司；三氟乙酸（≥99%）購于德國Merck 公司（Darmstadt, Germany）；甲醇（分析純）和甲酸（分析純）購自北京化工廠；HPLC 級水由Milli-Q 超純水系統(tǒng)（Millipore, Billerica，MA，USA）制備；黃酮醇標準品：蘆丁（純度91.7%）購自中國藥品生物制品檢定所。

1.2 化學成分提取

稱取扁蕾不同部位（花、葉、主莖、側(cè)枝、根）干燥粉末3 份，每份約100.00 mg，溶于10 mL 甲醇（甲酸的抽提溶劑），超聲提取30 min，離心（12 000 r/min，10 min），收集上清液。提取3 次后合并濾液，依次用濾紙及0.22 μm 的濾膜過濾。

1.3 定性分析及結(jié)構(gòu)鑒定

采用Agilent 1100 LC/MSD Trap VL 液質(zhì)聯(lián)用儀（HPLC-ESI-MSn）進行口山酮類化合物定性分析。色譜條件為：采用TSK gel ODS-80Ts QA（150 mm×4.6 mm，5 μm i.d.，Tosoh，Tokyo，Japan） 色譜柱，流動相組成：A 相為10%甲酸-水溶液；B 相為乙腈溶液，洗脫梯度為：0 min，10%B→20 min，22%B→65 min，60%B→70 min，10%B，檢測波長：330 nm，流速：0.8 mL/min，進樣量：10 μL，柱溫：25℃。質(zhì)譜電離源采用電噴霧電離（ESI），分別在正離子和負離子模式下進行全掃描，掃描范圍：（m/z）100～1 000 μ。正離子模式下的質(zhì)譜分析條件為：氮氣作為干燥和噴霧氣體，干燥溫度：350℃，氮氣流速：6.0 L/min，噴霧器壓力：241.3 KPa；毛細管電壓：3 500 KV，毛細管出口電壓：140 V；八級射頻電壓振幅：150 Vpp；skim 1 電壓：55.6 V，skim 2 電壓：6.0 V；cap exit offset：84.4 V。負離子模式下，參數(shù)設(shè)定值不同的為：毛細管出口電壓：-127.3 V；skim 1 電壓：-47.7 V，skim 2 電壓：-6.0 V；cap exit offset：-79.6 V。用LC/MSD Trap 軟件（5.2 版本）分析不同模式下的質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

1.4 定量分析

采用Dionex HPLC 系統(tǒng)對扁蕾中不同部位的化學成分進行定量分析。該系統(tǒng)包括P680 泵、TCC-100 自動控溫柱箱、PDA-100 光電二極管陣列檢測器及變色龍色譜工作站（Chromeleon，6.60版本）。色譜條件與化合物定性分析一致。利用標準品蘆丁分別對各化合物進行相對定量分析，重復3次，單位為每g 干燥扁蕾中含有的化合物mg 數(shù)。計算不同部位的各個組分含量，比較各部位之間不同化學成分的組成差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 扁蕾化學成分的定性分析

利用HPLC-ESI-MSn 從扁蕾全株樣品中檢測出11 種主要化合物成分（圖1），各化合物的紫外可見吸收光譜和質(zhì)譜數(shù)據(jù)如表1 所示。依據(jù)樣品HPLC 分析的保留時間、洗脫順序、紫外-可見吸收光譜和質(zhì)譜信息，通過與參考文獻比較推定了各化合物的結(jié)構(gòu)[5]。其中，正離子模式下的質(zhì)譜數(shù)據(jù)為化合物的結(jié)構(gòu)解析提供了更多信息。

圖1 扁蕾全株化學組成成分HPLC 圖譜

表1 扁蕾中化學成分的紫外-可見吸收光譜及ESI-質(zhì)譜數(shù)據(jù)

組分1 在紫外吸收光譜中的最大吸收波長為244、252、275 nm，為較典型的口山酮特征吸收。正離子模式下檢測到分子離子m/z 303（[M+H]+）和苷元碎片離子m/z 274（[Y0]+），負離子模式下檢測到碎片離子m/z 639（[2M+Cl]－），它與濕生扁蕾中的1-羥基-3，7，8-三甲氧基口山酮的裂解特征相同，因此推定組分1 為1-羥基-3，7，8-三甲氧基口山酮[6]。

組分2 在正離子模式下檢測到高豐度的加鈉分子離子m/z 328（[M+Na]+），負離子模式下檢測到分子離子m/z 304（[M-H]－），且碎片離子信息與文獻報道一致[7]，由于缺乏更多的結(jié)構(gòu)信息，暫推定組分2 為1，3，8-三羥基-5，6-二甲氧基口山酮。

組分3 在正離子模式下檢測到高豐度的加鈉分子離子m/z 445（[M+Na]+），負離子模式下檢測到分子離子m/z 421（[M－H]－），m/z 260 是苷元1，3，5，8-四羥基口山酮的特征質(zhì)荷比[13]。其與去甲當藥苷的裂解特征相同，結(jié)合紫外數(shù)據(jù)，推定組分3 為去甲當藥苷，質(zhì)譜信息和結(jié)構(gòu)圖如圖2（a）所示[8]。

組分4 在正離子模式下檢測到苷元碎片離子m/z 274（[M-162+H]+）及高豐度的加鈉分子離子m/z 459（[M+Na]+），負離子模式下檢測到去質(zhì)子分子離子m/z 273（[Y0]－）和m/z 435（[M－H]－），分子量是在苷元碎片離子（m/z 274）的基礎(chǔ)上加上一個己糖的分子量（162 u），再結(jié)合紫外可見吸收光譜數(shù)據(jù)，推定組分4 為當藥苦苷[9]，質(zhì)譜信息和結(jié)構(gòu)圖如圖2（b）所示。

組分5 在正離子模式下得到加納分子離子m/z 488（[M+Na]+），負離子模式檢測到顯著的分子離子m/z 465（[M－H]－），且紫外光譜在243、254、330 nm處出現(xiàn)特征吸收，結(jié)合文獻報道，推定組分5 為蔓龍膽口山酮苷[10]。

組分6 的紫外光譜在263 nm、266 nm 處出現(xiàn)肩峰，為環(huán)烯醚萜苷類化合物的特征吸收峰，正譜數(shù)據(jù)為分子離子m/z 359（[M+H]+）及苷元原子m/z 197（[Y0]+），負譜數(shù)據(jù)為m/z 403（[M+HCOO]－）及碎片離子m/z 190（[Y0]－），與文獻中獐牙菜苷的數(shù)據(jù)一致，因此，推定組分6 為獐牙菜苷[11]。

組分7 的質(zhì)譜數(shù)據(jù)為正離子模式下高豐度分子離子m/z 260（[M+H]+），m/z 260 是1，3，5，8-四羥基口山酮的特征質(zhì)荷比[12]。負離子模式下也檢測到碎片離子m/z 555（[2M+Cl]－），結(jié)合紫外吸收數(shù)據(jù)，推定峰7 為1，3，5，8-四羥基口山酮，質(zhì)譜信息和結(jié)構(gòu)圖如圖2（c）所示。

組分8 的紫外吸收為206、218、269 nm，可知組分8 為口山酮類化合物的五氧取代類型，正離子模式下含有碎片離子m/z 631（[2M+Na]+）和分子離子m/z 304（[M+H]+），負離子模式下檢測到m/z 337（[M+Cl]－）?？谏酵惢衔锶糁挥辛u基和甲氧基取代，其不飽和度為10，故推測其分子組成為C15H12O6，通過與文獻的光譜數(shù)據(jù)進行比較，可推定峰8 為1，5，8-三羥基-3，4-二甲氧基口山酮[13]。

峰9 正離子模式下檢測到顯著的分子離子m/z 519（[M+H]+），負離子模式下也檢測去質(zhì)子分子離子m/z 564（[M+HCOO]－）和碎片離子m/z 325（[Y0]－），紫外最大吸收為237、257、283 nm，峰9 的質(zhì)譜信息與從大籽獐牙菜分離到的新口山酮類化合物Swertiabisxanthone 一致，由于缺乏更多的信息，暫推定組分9 為Swertiabisxanthone[14－15]。

圖2 扁蕾中4 種主成分的正譜質(zhì)譜圖和結(jié)構(gòu)圖

組分10 正離子模式下檢測到顯著的分子離子m/z 274（[M+H]+），負離子模式下檢測到去甲基碎片離子m/z 258（[M-CH3-H]－），m/z 274 是龍膽山酮酚的特征質(zhì)荷比，再結(jié)合其在色譜柱中的洗脫順序和紫外可見吸收光譜數(shù)據(jù)，故確定組分10 為龍膽山酮酚[15]，質(zhì)譜信息和結(jié)構(gòu)圖如圖2（d）所示。

組分11 在紫外吸收光譜中的最大吸收波長為208、225、260 nm，且為口山酮類化合物的四氧取代類型。正離子模式下檢測到加納分子離子峰m/z 313（[M+Na]+）和碎片離子m/z 274（[Y0]+），負離子模式下檢測到苷元離子m/z 289（[M-H]－），與文獻的光譜數(shù)據(jù)進行比較，推定組分11 為1，7-二羥基-3，8-二甲氧基口山酮[2,16]。

2.2 扁蕾不同部位中化合物定量分析

扁蕾不同部位化合物的含量差異如表2 所示。其中去甲當藥苷、當藥苦苷、1，3，5，8-四羥基口山酮和龍膽山酮酚為扁蕾的4 種主要組成成分。扁蕾各部位的口山酮類化合物總含量的分布狀態(tài)為：花>葉>側(cè)枝>主莖>根，含量最多的為花器官，根中含量很低。

表2 扁蕾不同部位的組成成分分析 （mg）

3 小結(jié)與討論

通過高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HPLCESI-MSn）檢出了大興安嶺地區(qū)產(chǎn)傳統(tǒng)蒙藥扁蕾不同部位的化學成分共11 種化合物，其中9 種化合物首次從扁蕾中檢測到。扁蕾不同部位的化合物定量分析結(jié)果表明，檢出的11 種化合物中，去甲當藥苷、當藥苦苷、1，3，5，8-四羥基口山酮和龍膽山酮酚為扁蕾的4 種主要組成成分；口山酮類總含量分布狀態(tài)為：花>葉>側(cè)枝>主莖>根，地上部分口山酮種類豐富，與地下部分化學成分存在顯著差異，建議以扁蕾地上部分入藥。這為闡明將扁蕾開發(fā)成治療藥物及應用的最佳藥用部位提供了客觀可靠的理論依據(jù)，為該藥材的品質(zhì)評價和開發(fā)利用提供科學參考。

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