陳春華，劉小琴，王永忠

（江蘇省常州市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 213001）

結(jié)核分枝桿菌臨床分離株分型及耐藥性分析

陳春華，劉小琴，王永忠

（江蘇省常州市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 213001）

目的分析結(jié)核分枝桿菌臨床分離株菌型的鑒定及其對6種抗結(jié)核藥物的藥敏檢測結(jié)果，為臨床制訂治療方案提供依據(jù)。方法 采用BacT／Alert 3D系統(tǒng)培養(yǎng)液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)陽性標(biāo)本接種在L－J藥敏培養(yǎng)基，進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌菌型鑒定，并進(jìn)行耐藥結(jié)果分析。結(jié)果92株結(jié)核分枝桿菌中，人結(jié)核分枝桿菌24例，牛結(jié)核分枝桿菌68例，分別對其做抗結(jié)核藥物異煙肼（INH）、利福平（RFP）、乙胺丁醇（EMB）、鏈霉素（SM）、左氧氟沙星（LVFX）、丁胺卡那（AMK）的兩種藥物濃度的藥敏試驗(yàn)。人結(jié)核分枝桿菌和牛結(jié)核分枝桿菌對各種藥物耐藥率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；低濃度藥物的耐藥率明顯高于高濃度藥物耐藥率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。6種高濃度抗結(jié)核藥的耐藥率SM＞INH＞EMB＞AMK＞RFP＞LVFX。結(jié)論INH、RFP、EMB、SM、LVFX、AMK可作為常規(guī)抗結(jié)核藥物，為臨床醫(yī)師根據(jù)常規(guī)抗結(jié)核藥物藥敏結(jié)果制定更加有效的抗結(jié)核治療方案提供重要的借鑒。

分枝桿菌，結(jié)核；微生物敏感性試驗(yàn)；抗結(jié)核藥

結(jié)核病是目前嚴(yán)重威脅人類健康的重大傳染病之一，是單病因所致的感染性疾病中死亡率最高的疾病，尤其是耐藥結(jié)核病的發(fā)病率呈上升趨勢，嚴(yán)重威脅人類的身體健康，中國是全球結(jié)核病的重災(zāi)區(qū)，結(jié)核病發(fā)病總?cè)藬?shù)居全球第二。由于不規(guī)范的抗結(jié)核治療導(dǎo)致耐藥結(jié)核分枝桿菌，尤其是MDR－TB的產(chǎn)生與傳播是造成全球結(jié)核病嚴(yán)峻形勢的主要形勢之一，2006年以來XDR－TB的出現(xiàn)使得結(jié)核病的防控更加棘手［1－2］。為了選擇快速、簡便、價(jià)格低廉且適合基層實(shí)驗(yàn)室分枝桿菌分離培養(yǎng)及其藥敏試驗(yàn)的方法，筆者選擇了BacT／Alert 3D系統(tǒng)進(jìn)行液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，由于BacT／Alert 3D系統(tǒng)儀器和試劑價(jià)格昂貴［3］，分枝桿菌培養(yǎng)法是結(jié)核病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)［4］。因此陽性標(biāo)本采用L－J藥敏培養(yǎng)基進(jìn)行試驗(yàn)，成本低，適合基層結(jié)核病?？漆t(yī)院大批量的結(jié)核培養(yǎng)為臨床提供快速、準(zhǔn)確的藥敏結(jié)果，為臨床醫(yī)師能合理用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株（H37RvATCC27294）作為標(biāo)準(zhǔn)野生株對照。收集本院2011年4～9月92例住院肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本，年齡14～79歲，平均年齡35歲，所選病例經(jīng)臨床明確診斷。

1.2 儀器與試劑 采用梅里埃公司的BacT／Alert 3D全自動分枝桿菌檢測系統(tǒng)和配套試劑，L－J藥敏培養(yǎng)基由無錫博慧斯生物醫(yī)藥科技有限公司提供，萋尼氏染液由珠海貝索生物技術(shù)有限公司提供，37℃培養(yǎng)箱由上海一恒科學(xué)儀器公司提供。

表1 92株結(jié)核分枝桿菌藥敏結(jié)果［（%）、μg／mL］

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本前處理 按照《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》操作［5］，采用NaCl－NaOH法進(jìn)行標(biāo)本處理。囑咐患者咳取呼吸道深部的痰液1～2mL，視痰標(biāo)本性質(zhì)加入1～2倍量的NaCl－NaOH消化液，漩渦混勻靜止待痰液完全液化后，倒入10mL在離心管以3 000r／min離心25min，傾去上清液，留取沉渣加入0.067mmol／L磷酸鹽緩沖液（PBS）1mL混勻備用。

1.3.2 BacT／Alert 3D系統(tǒng)分離培養(yǎng) 用10mL復(fù)溶液溶解1瓶抗菌藥物干粉，在接種標(biāo)本前，加0.5mL的抗菌藥物添加劑至BacT／Alert 3DMP處理培養(yǎng)瓶中，然后每瓶接種0.1mL經(jīng)NaCl－NaOH法處理的標(biāo)本，接種后，培養(yǎng)瓶經(jīng)掃描確認(rèn)，放入BacT／Alert 3D全自動分枝桿菌培養(yǎng)儀中，由儀器自動檢測。儀器提示陽性后取出涂片經(jīng)抗酸染色證實(shí)為抗酸分枝桿菌后報(bào)告陽性，陰性在30d后儀器報(bào)告陰性后取出。

1.3.3 菌群鑒定和藥敏培養(yǎng) 按照結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程進(jìn)行菌群鑒定［4］。經(jīng)BacT／Alert 3D系統(tǒng)分離培養(yǎng)陽性的標(biāo)本分別接種在藥敏L－J培養(yǎng)基培養(yǎng)的異煙肼（INH）、利福平（RFP）、乙胺丁醇（EMB）、鏈霉素（SM）、左氧氟沙星（LVFX）、丁胺卡那（AMK）6種抗結(jié)核藥物（絕對濃度法）的培養(yǎng)基的斜面上，結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株（H37RvATCC27294）作為標(biāo)準(zhǔn)野生株對照，另外每個標(biāo)本接種2支改良羅氏培養(yǎng)基的作為對照，接種1支含5μg／mL噻吩－2－羧酸肼（TCH），1支含500 μg／mL對硝基苯甲酸（PNB），作為菌型鑒定。經(jīng)37℃恒溫培養(yǎng)4周后，觀察結(jié)果并進(jìn)行藥物敏感性鑒定。TCH和PNB二者均陰性為牛結(jié)核分枝桿菌，二者均陽性為非結(jié)核分枝桿菌，TCH陽性PNB陰性為人結(jié)核分枝桿菌。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，各種耐藥率采用百分率計(jì)算，耐藥率（%）＝陽性株數(shù)／人結(jié)核菌株數(shù)或牛結(jié)核菌株數(shù)。耐藥率兩兩比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

選取的100例在BacT／Alert 3D系統(tǒng)結(jié)核培養(yǎng)陽性標(biāo)本接種于藥敏L－J培養(yǎng)基分型，其中人結(jié)核分枝桿菌24例，牛結(jié)核分枝桿菌68例，非結(jié)核分枝桿菌8例（本文未討論）。人結(jié)核分枝桿菌和牛結(jié)核分枝桿菌對各種藥物耐藥率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），低濃度藥物的耐藥率明顯高于高濃度藥物耐藥率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。6種高濃度抗結(jié)核藥的耐藥率SM＞INH＞EMB＞AMK＞RFP＞LVFX，結(jié)果見表1。

3 討 論

本研究結(jié)果顯示，人結(jié)核分枝桿菌24例，牛結(jié)核分枝桿菌68例，牛結(jié)核分枝桿菌占73.9%（68／92），兩種菌型耐同種藥物的耐藥率作比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。因此，人結(jié)核分枝桿菌和牛結(jié)核分枝桿菌在選擇用藥方面無顯著性差異。藥敏試驗(yàn)的藥物濃度采用低濃度和高濃度兩種，結(jié)果顯示，耐低濃度藥物的耐藥率明顯高于耐高濃度藥物耐藥率，二者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。從高濃度的耐藥率來看，SM＞INH＞EMB＞AMK＞RFP＞LVFX，其中SM 最高26.3%（9.1＋17.3），其次是INH 20%（11.5＋9.1），這可能與20世紀(jì)80年代中期以來抗結(jié)核化療方案以SM、INH的組合有關(guān)［6］。近年來，由于SM的不良反應(yīng)耐藥相對較多，逐漸將EMB替代SM用于結(jié)核病患者治療，所以一線的4種藥物耐藥率SM＞INH＞EMB＞RFP，二線抗結(jié)核藥AMK和LVFX也有一定的耐藥率，高濃度的AMK和LVFX耐藥率為（4.3%～4.6%），因此對一線抗結(jié)核藥物不良反應(yīng)較大的結(jié)核病患者，可以優(yōu)先選擇AMK和LVFX這兩種藥物治療。提示治療MDR－TB的過程中，需防止XDR－TB的出現(xiàn)，有效降低耐多藥率。臨床醫(yī)生可以有效地參考結(jié)核分枝桿菌藥敏檢測結(jié)果從而制定更加合理有效的治療方案。

［1］Banerjee R，Schecter GF，F(xiàn)lood J，et al.Extensively drugresistant tuberculosis:new challenges［J］.Expert Rev Anti Infect Ther，2008，6（5）:713－724.

［2］Gandhi NR，Moll A，Sturm AW，et al.Extensively drugresistant tuberculosis as a cause of death in patients co－infected with tuberculosis and HIV in a rural area of South Africa［J］.Lancet，2006，238（9547）:1554－1556.

［3］沈麗，王易偉，王宇.二種不同方法對結(jié)核菌培養(yǎng)和藥敏的優(yōu)勢互補(bǔ)［J］.臨床肺科雜志，2002，7（2）:13－15.

［4］張羽，盧建平，葉淼.四種結(jié)核分枝桿菌檢測方法的臨床應(yīng)用評價(jià)［J］.中國防癆雜志，2006，28（1）:14－17.

［5］中國防澇協(xié)會基礎(chǔ)專業(yè)委員會.結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程［M］.北京:中國教育文化出版社，2006:36－39.

［6］沈秀平，徐瑞興，呂晶.北京西城區(qū)新發(fā)肺結(jié)核病人起始耐藥性監(jiān)測［J］.中國防癆雜志，1999，21（1）:71－91.

10.3969／j.issn.1671－8348.2012.34.028

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1671－8348（2012）34－3641－02

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