鐘植文，蘇偉桐，江鵬華，周澤標(biāo)，劉鎮(zhèn)明，楊傲冰

(1．廣東永順生物制藥有限公司，廣州 511356;2．華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510642)

2010年4月以來，我國部分地區(qū)陸續(xù)發(fā)生一種新疾病，以產(chǎn)蛋鴨產(chǎn)蛋急劇下降，卵泡變性，卵泡膜出血為特征，目前有報道確定為由鴨黃病毒引起［1－3］。廣東清遠地區(qū)某商品蛋鴨場，6000只蛋鴨1周前開始出現(xiàn)減料降蛋。至2011年9月18日，產(chǎn)蛋量從原來每天4800枚降至2800枚，即產(chǎn)蛋率從80%降至46．7%，下降了33．3%;而飼料量從原來每天25包降至20包，即采食量從每只鴨每天167 g降至133 g，下降了20%。對病死鴨只進行解剖，病變主要為卵泡充血、出血(圖1)。本文對廣東清遠地區(qū)某商品蛋鴨場該病進行診斷研究。

圖1 病死鴨卵泡充血、出血

1 材料與方法

1．1 細菌分離 無菌采取廣東清遠地區(qū)某商品蛋鴨場病(死)產(chǎn)蛋種鴨的肝臟、脾臟、心血等，接種于普通營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂、鮮血液瓊脂等培養(yǎng)基，置37℃溫箱培養(yǎng)。

1．2 病毒分離和傳代 采取廣東清遠地區(qū)某商品蛋鴨場病(死)產(chǎn)蛋種鴨的肝臟、脾臟、肺、卵巢等內(nèi)臟組織，按常規(guī)方法勻漿后，反復(fù)凍融3次，3500 r/min離心10 min，吸取上清液，加入青鏈霉素，終濃度均為1萬單位/mL，4℃作用2 h，再經(jīng)細菌濾器過濾除菌，保留濾液。濾液經(jīng)尿囊腔途徑接種9日齡鴨胚(由廣東永順生物制藥有限公司提供)8只，每只0．3 mL。接種后置37℃溫箱孵化，每天照胚4次，連續(xù)觀察7 d。觀察死亡鴨胚病變，收獲死亡鴨胚尿囊液，無菌檢查后命名為QS株，然后連續(xù)傳代，同時開始進行雞胚傳代。

1．3 血凝試驗 參照文獻［4］，配制1%鴨、雞紅細胞懸液，分別進行微量血凝試驗。

1．4 PCR、RT－PCR鑒定和序列測定分析 根據(jù)實驗初步結(jié)果，分別針對鴨瘟病毒UL6基因，禽流感病毒M基因，禽副粘病毒Ⅰ型F基因，鴨肝炎病毒VP1基因和黃病毒屬Tembusu病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白NS5基因設(shè)計引物，引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。其中，針對Tembusu病毒NS5基因設(shè)計的引物序列為P1:5’－GACACTAGAATAACCAAG －3’，P2:5’－GCGAATCTGTCATCTGCT－3’。用 Takara Universal Genomic DNA Extraction Kit提取接種QS株的鴨胚尿囊液的病毒總DNA，再用針對鴨瘟病毒UL6基因所設(shè)計的特異性引物進行PCR擴增。用Takara MiniBEST Viral RNA Extraction Kit提取接種QS株的鴨胚尿囊液的病毒總RNA，用隨機引物為反轉(zhuǎn)錄引物合成cDNA，再分別用針對禽流感病毒M基因、禽副粘病毒Ⅰ型F基因，鴨肝炎病毒VP1基因和Tembusu病毒NS5基因所設(shè)計的特異性引物進行PCR擴增。另外，再用Takara MiniBESTViral RNA Extraction Kit提取健康鴨胚尿囊液的病毒總RNA，隨機引物為反轉(zhuǎn)錄引物合成cDNA，針對Tembusu病毒NS5基因所設(shè)計的特異性引物進行PCR擴增，并作為對照，所有的PCR和RT－PCR產(chǎn)物一起電泳檢測結(jié)果。將陽性產(chǎn)物經(jīng)回收純化后送英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司進行序列測定。用 BLAST(http://blast．ncbi．nlm．nih．gov/Blast．cgi)進行相似性檢索，用CLUSTALW比較序列相似性，用MEGA 4．0構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1．5病毒對鴨胚的ELD50測定 參照文獻［5］，將QS株第3代病毒液以滅菌生理鹽水配制成10－5～10－1的病毒液，每個稀釋度分別經(jīng)尿囊腔途徑接種8只9日齡鴨胚，每只0．2 mL。每天照胚4次，24 h內(nèi)死亡胚棄去不計數(shù)，之后每天記錄死胚情況，連續(xù)觀察7 d，按Reed－Muench法計算病毒的ELD50。

2 結(jié)果

2．1 細菌分離 病料接種的普通營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂、鮮血液瓊脂等培養(yǎng)基均無菌落生長，初步排除細菌感染的可能性。

2．2 病毒分離和傳代 經(jīng)處理的病料接種9日齡鴨胚，孵化68 h開始出現(xiàn)死亡。死亡胚體全身出血，尤其是頭、頸、腳出血明顯(圖2)。收獲死亡鴨胚尿囊液，無菌檢查為陰性。進行鴨胚傳代，連續(xù)傳9代。鴨胚的死亡率均為100%，死亡時間集中在68～96 h。取第3代鴨胚尿囊液，接種9日齡雞胚，89 h開始出現(xiàn)死亡，死亡胚體嚴(yán)重出血，而死亡時間不集中，在89～143 h之間。初步確定為病毒性感染。

圖2 接種QS株后的鴨胚

2．3 血凝試驗 每一代鴨胚尿囊液和雞胚尿囊液均不能凝集鴨和雞紅細胞，表明QS株對鴨和雞紅細胞無血凝性。

圖3 QS株病毒PCR和RT－PCR檢測結(jié)果

2．4 PCR、RT－PCR鑒定和序列測定分析 用針對黃病毒屬Tembusu病毒NS5基因所設(shè)計的特異性引物進行RT－PCR擴增，結(jié)果顯示擴增片段大小約為400 bp，而針對禽流感病毒M基因，禽副粘病毒Ⅰ型F基因，鴨肝炎病毒VP1基因和鴨瘟病毒UL6基因，所設(shè)計的特異性引物均未能擴增出任何預(yù)期片段(圖3)。將目的條帶回收純化后，經(jīng)測序后對獲得序列進行分析，擴增片段為419 bp。用Blastn進行比較分析，發(fā)現(xiàn)與黃病毒屬中的Tembusu病毒相似性最高，其中與Tembusu病毒Fengxian株相似性高達99%，而與黃病毒屬其它毒株如YY5株、CJD05/CHN/2010株和SD/CHN/2010株相似性均達98%?；贜S5基因部分片段建立系統(tǒng)進化樹，QS株和黃病毒屬Fengxian株等多個毒株處于同一分支，而Tembusu病毒Sitiawan株等多個毒株處于另一分支(圖4)，這些都表明QS株與Tembusu病毒親緣關(guān)系很近，也屬于黃病毒屬。

2．5 病毒對鴨胚的ELD50測定 QS株的鴨胚尿囊液稀釋后接種9日齡鴨胚，10－1和10－2稀釋度的病毒液接種的8只鴨胚，死亡率均8/8，10－3稀釋的病毒液接種的，死亡率為7/8，10－4稀釋的病毒液接種的，死亡率為2/8，10－5稀釋的病毒液接種的死亡率為0/8。按Reed－Muench法計算，QS株對鴨胚的ELD50為 10－3．6/0．2mL。

圖4 基于NS5基因部分片段建立的系統(tǒng)進化樹

3 討論

3．1 接種鴨胚的死亡情況及PCR、RT－PCR鑒定和序列測定分析結(jié)果顯示，本次從廣東省清遠地區(qū)商品蛋鴨場病死鴨中分離的病毒QS株與黃病毒屬中的Tembusu病毒親緣關(guān)系很近，同屬于黃病毒屬。

3．2 QS株對鴨和雞紅細胞均無血凝性，表明QS株不屬于 AIV、NDV、EDSV［5－6］。

［1］ 李玉峰，馬秀麗，于可響，等．一種新病原——鴨黃病毒的分離與初步鑒定［J］．家禽科學(xué)，2011，5:12 －14．

［2］ 萬春和，施少華，程龍飛，等．一種引起種(蛋)鴨產(chǎn)蛋驟降新病毒的分離與初步鑒定［J］．福建農(nóng)業(yè)學(xué)報，2010，25(6):663 －666．

［3］ 曹貞貞，張 存，黃 瑜，等．鴨出血性卵巢炎的初步研究［J］．中國獸醫(yī)雜志，2010，46(12):3 －7．

［4］ 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部，高致病性禽流感診斷技術(shù)(GB/T 18936－2003)［S］．

［5］ 辛朝安．禽病學(xué)［M］．北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2003:40－84．

［6］ 殷 震，劉景華．動物病毒學(xué)［M］．第二版．北京:科學(xué)出版社，1997:262 －264，351 －354，632．