虞佳燕，丁國(guó)芳

（1.舟山醫(yī)院，浙江 舟山316004；2.浙江海洋學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江 舟山316004）

PAS和CK雙重染色法在胃粘膜活檢標(biāo)本中的應(yīng)用

虞佳燕1，丁國(guó)芳2

（1.舟山醫(yī)院，浙江 舟山316004；2.浙江海洋學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江 舟山316004）

目的：通過(guò)運(yùn)用免疫組化染色和黏液特殊染色2種染色方法，對(duì)同一張胃鏡活檢標(biāo)本進(jìn)行PAS和CK的雙重染色，提高胃鏡活檢標(biāo)本的利用率以及微小癌灶的檢出率。方法：選取本院2010年胃鏡診斷胃黏膜重度非典型增生和各型腺癌標(biāo)本134例，在同一張切片上先實(shí)行PAS染色，然后實(shí)行CK染色，其結(jié)果與H-E染色進(jìn)行比較。結(jié)果：中性黏液PAS染色胞漿呈紫紅色，胞核呈藍(lán)色；胃腺癌細(xì)胞質(zhì)CK陽(yáng)性，呈棕黃色，雙重染色陽(yáng)性116例，H-E染色陽(yáng)性100例，χ2檢驗(yàn)分析，P＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：雙重染色在胃鏡活檢黏膜中的應(yīng)用可以有效提高胃鏡活檢標(biāo)本的利用率和早期胃癌的檢出率，值得在廣大基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)推廣。

胃鏡活檢；免疫組化；粘液特染；雙重染色；病理診斷

胃癌是在各種惡性腫瘤中發(fā)病率和死亡率非常高的腫瘤［1］，內(nèi)鏡下取活檢是早期診斷胃癌最準(zhǔn)確和直接的方法，不僅可以了解腫瘤的部位、大小、大體類(lèi)型，還能進(jìn)行病理分型，已得到廣泛應(yīng)用［2］。但是通常胃鏡活檢黏膜常規(guī)制片后發(fā)現(xiàn)微小癌巢，需要做免疫組化染色和黏液特殊染色才能進(jìn)一步確診，但常遇到活檢標(biāo)本太小，重新切片時(shí)癌組織已缺如，無(wú)法對(duì)上皮細(xì)胞進(jìn)行免疫標(biāo)記以及采用黏液特殊染色進(jìn)行標(biāo)記，給臨床病理診斷帶來(lái)較大困難。針對(duì)我院每年有一萬(wàn)余例胃黏膜活檢標(biāo)本，我們經(jīng)過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在同一張切片上進(jìn)行上皮細(xì)胞角蛋白免疫組織化學(xué)染色標(biāo)記（cytokeratin，CK）和黏液染色標(biāo)記（periodic acid schiff，PAS），可有效解決這一難題。

1 材料與方法

1.1 材料

選取本院2010年1月至2010年12月送檢胃鏡診斷重度非典型增生16例，高分化腺癌標(biāo)本62例，低分化腺癌標(biāo)本30例，粘液腺癌標(biāo)本26例。經(jīng)10%福爾馬林固定，常規(guī)脫水，透明，切片石蠟包埋，切片厚3～4μm，裱在涂有防脫片劑的（10%多聚賴(lài)氨酸）清潔載玻片上。全部標(biāo)本進(jìn)行連續(xù)切片，采用PAS和CK雙重染色，將單一的H-E染色與雙重染色作對(duì)照。

1.2 試劑

（1）0.5%過(guò)碘酸水溶液：過(guò)碘酸0.5g，蒸餾水加至 100mL；（2）無(wú)色品紅液：堿性品紅 1g，蒸餾水200mL，1mol/L鹽酸20ml，偏重亞硫酸 1.5g，活性碳1.5g；（3）免疫組化試劑：一抗（鼠抗人）CK 及 EnVision試劑（即用型）均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)公司。另備用 0.01mol/L pH7.4PBS，0.01mol/L pH7.8 TBS，3，3- 二氨基聯(lián)苯胺鹽酸鹽（DAB），熱修復(fù)介質(zhì)0.01mol/L pH6.0檸檬酸緩沖液。

1.3 方法

1.3.1 操作步驟

第一步：黏液特殊染色（PAS），石蠟切片60°C烤箱過(guò)夜，切片脫蠟水化后，按過(guò)碘酸—無(wú)色品紅法染中性黏液：（1）0.5%過(guò)碘酸水溶液氧化10分鐘，流水沖洗2分鐘；（2）入無(wú)色品紅液于暗處加蓋作用10～20分鐘，流水沖洗2分鐘；（3）以0.2%稀醋酸溶液作為洗脫液將切片洗3分鐘×3次。

第二步：免疫組化染色 采用EnVision二步法進(jìn)行的細(xì)胞角蛋白標(biāo)記（CK）。蒸餾水浸洗3分鐘×3次，PBS緩沖液充分沖洗 PBS浸洗3分鐘×3次；（1）高溫修復(fù)（檸檬酸）2分鐘，冷卻，PBS浸洗3分鐘×3次。（2）3%過(guò)氧化氫37°C孵育10分鐘，PBS浸洗 3分鐘 ×3次；（3）滴加一抗 37°C孵育60min，PBS浸洗 3分鐘×3次；（4）滴加二抗37°C 孵育30分鐘，PBS浸洗3分鐘×3次。DAB顯色，鏡下觀察顯色效果，自來(lái)水沖洗3分鐘。Harris蘇木素復(fù)染2分鐘，水洗，1%鹽酸分化，流水沖洗10分鐘。梯度酒精脫水，中性樹(shù)膠封固。

雙重染色后，顯微鏡下觀察PAS和CK雙染表達(dá)情況。

1.3.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.3統(tǒng)計(jì)軟件包處理，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 H-E染色與CK和PAS雙重染色陽(yáng)性率比較

除高分化腺癌經(jīng)H-E染色與CK和PAS雙重染色陽(yáng)性率沒(méi)有差異外，其余3種病變雙重染色的陽(yáng)性率都高于H-E染色。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見(jiàn)表 1。

表1 H-E染色與CK和PAS 雙重染色的比較

2.2 PAS和CK在重度非典型增生的胃粘膜與高分化腺癌的對(duì)比表達(dá)

圖A為H-E染色交界性病變的胃黏膜，經(jīng)CK染色間質(zhì)中見(jiàn)散在的陽(yáng)性細(xì)胞（圖B），PAS染色后粘液在腺細(xì)胞內(nèi)明顯，間質(zhì)中也見(jiàn)部分陽(yáng)性細(xì)胞（圖C）。CK及PAS雙重染色，細(xì)胞質(zhì)和少量細(xì)胞核呈棕黃色（圖D）。

圖1 胃腺癌標(biāo)本經(jīng)雙重染色和單一染色陽(yáng)性表達(dá)

3 討論

黏液特殊染色（PAS）能很好顯示糖原及中性黏液，在胃癌黏膜表面上皮和癌細(xì)胞組織內(nèi)PAS均呈陽(yáng)性，因此可以鑒別癌細(xì)胞是否浸潤(rùn)間質(zhì)［3-4］。但是用于特殊染色的高碘酸液配制必須新鮮。免疫組化染色中CK主要標(biāo)記胃腸道上皮，用于診斷胃腸道腺癌。隨著高溫高壓抗原修復(fù)技術(shù)逐漸被實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可和應(yīng)用［5］，免疫組化染色過(guò)程中采用高溫高壓修復(fù)。于高壓鍋出蒸汽90s后迅速移開(kāi)熱源，放置于事先備好的冷水中冷卻。修復(fù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，易導(dǎo)致非特異性染色，不足則不能充分暴露抗原決定簇［6］。

如圖A所示，H-E染色的交界性病變，通常不能明確診斷為重度非典型增生或高分化腺癌。因此需要做CK染色（圖B）和PAS染色（圖C），然后再對(duì)比2張切片中相同組織的顯色情況，以此鑒別診斷。但是工作中經(jīng)常遇到胃鏡下鉗取活檢標(biāo)本體積小、量少、較淺表，組織經(jīng)過(guò)反復(fù)切片有診斷意義的部位容易被切去，故而找不到相同組織的對(duì)照部位，并且分別單項(xiàng)染色步驟煩瑣。我們?cè)谝粡埥M織切片中相繼做黏液特殊染色與免疫組化雙重染色（圖D），無(wú)異于連續(xù)切片后單獨(dú)染色，避免了反復(fù)切片，縮短了時(shí)間，并且有效避免了由于病灶較小被切完的可能性。雙重染色后生成物顯示在組織細(xì)胞的不同部位，黏液湖中散在棕黃色腫瘤細(xì)胞，各種染色顯示的顏色不相互遮蓋、不相互干擾，且色彩鮮艷，對(duì)比明顯，定位清晰，染色效果佳，與H-E常規(guī)染色切片比較，結(jié)果令人滿(mǎn)意。根據(jù)本文結(jié)果分析顯示，該技術(shù)在胃黏膜重度非典型增生和低分化腺癌以及黏膜黏液腺癌的診斷中，能及時(shí)為臨床提供準(zhǔn)確的病理診斷，對(duì)患者治療及愈后提供了積極的幫助。

運(yùn)用CK和PAS雙重染色法可以提高胃鏡微小活檢標(biāo)本的利用率，同時(shí)提高早期胃癌、低分化腺癌和粘液腺癌的檢出率，同時(shí)該方法也可以用于外地來(lái)會(huì)診的單張切片。雙重染色有助于明確診斷，并且該方法操作易行，用材簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)，值得在基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)推廣。

［1］李明今，崔銀姬，李柱虎，等.胃癌中CD44s和 CD44V6的表達(dá)及意義［J］.臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2009，25（1）：417-418.

［2］Karube T，Ochiai T，Shimada H ，et a1.Detection of sentinel lymph nodes in gastric cancers based on immunohistochemical analysis of micrometastases［J］.Surg Oncol，2004，87（1）：32.

［3］王軍，青年人胃鏡活檢胃癌62例臨床分析［J］.內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2010，29（12）：64-65.

［4］Trere D，Ceccarelli C，Migaldi M，et al.Cell proliferation in breast cancer is a major determinant of clinical outcon，in node-positive but not in node-negative patients［J］.Appl Immunohistochem Mol Morphol，2006，14（3）：314-323.

［5］凌啟波.實(shí)用病理特殊染色和組織化學(xué)技術(shù)［M］.廣州：廣東高等教育出版社，1989.72-73.

［6］孟奎，周曉軍.免疫組織化學(xué)病理診斷中抗體及檢測(cè)系統(tǒng)的選擇［J］.臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2004，20（5）：629-631.

Application of double dyeing technique in gastroscope biopsy specimens

YU Jiayan1，DING Guofang2
（1.Zhoushan Hospital，Zhejiang 316004，China；2.Medical College of Zhejiang Ocean University，Zhejiang 316004，China）

ObjectiveBy using immunohistochemistry and mucoid special staining，a gastroscope biopsy specimens were dyed by the CK and PAS to improve the utilization rate of the gastroscope biopsy specimens and the detection rate of small cancer lesion.MethodSpecimens from 90 patients diagnosed as adenocarcinoma in 2010 were dyed first by immunochemistry and then by mucoid special staining.ResultCancer cells are tan-yellow in the CK positive；Cytoplasm is purple and the nucleuses appear blue in the neutral mucous PAS staining.ConclusionApplication of double dyeing technique in endoscopic biopsy mucosa can be effectively improved the utilization ratio and tiny cancer detection rate.It is worth applying in the basic-level hospital.

gastroscope biopsy；iImmunohistochemistry；special dye；double dyeing；pathology diagnosis

B

1672-0024（2012）01-0048-04

虞佳燕（1981-），女，浙江舟山人，本科，技師。研究方向：消化道疾病病理技術(shù)

舟山市科技局科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：2010-134）