蘆花雞PRKAG3基因單核苷酸多態(tài)性及與肉質性狀的相關性分析

哈?！ぐ涂耍瑥堄篮?，郭 將，李傳民，馬 倩，趙衍銅，邱崢艷，張嘉保，趙志輝*

(1.吉林大學 畜牧獸醫(yī)學院，吉林 長春 130062;2.吉林大學 實驗動物中心，吉林 長春 130062)

AMPK(adenosine monophosphate activated protein kinase)是一種能被腺苷一磷酸(AMP)激活的蛋白激酶，在動物應激時通過改變機體內脂類和糖代謝起著重要作用。AMPK是一個異三聚體酶復合體，包含一個催化α亞基，以及調控的β和γ亞基。7個不同的亞型(α1，α2，β1，β2，γ1，γ2 和γ3)由不同的基因編碼。部分研究表明，在AMPK亞基基因中自然出現的突變能引起顯著的表型效應。PRKAG3基因是編碼一磷酸腺苷激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)調節(jié)亞基 γ3的基因，包含13個外顯子和12個內含子，主要在骨骼肌中 表 達[1，2]， 與 糖 代 謝 有 關， 通 過 調 節(jié)AMPK的活性來調節(jié)機體的能量平衡，通過磷酸化作用抑制糖原合成酶活性，降低糖原的合成速率，促進肌肉對葡萄糖的吸收能力，從而提高骨骼肌中肌糖原含量，進而對肉質品質產生影響[3～5]，是近年來確定的一個影響豬肉質pH值、肉色以及系水力的主效基因。

目前，國內外對蘆花雞PRKAG3基因的相關研究報道比較少，因此研究其肉質性狀與遺傳標記之間的關系將具有重要的理論和現實意義。本研究以蘆花雞為研究對象，以PRKAG3基因作為候選基因，采用PCRSSCP的方法分析PRKAG3基因外顯子11多態(tài)性，并與肉質性狀的相關性進行分析，旨在進一步認識蘆花雞種質特性，以期對蘆花雞的選種、早期選育、雜種優(yōu)勢的利用等提供基礎參數，為蘆花雞改良育種和新品系的培育提供理論依據和實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗屠宰的蘆花雞均來自吉林省農業(yè)科學院，飼養(yǎng)環(huán)境和條件相同，從而避免了牧場效應和環(huán)境因素對試驗結果的影響。87只蘆花雞頸靜脈放血處死后取其胸肌組織，一側胸肌用于基因組DNA的提取，-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?，另一側胸肌用于肉質性狀的測定。

1.2 常規(guī)肌肉品質測定

pH值:在屠宰后45 min內用pH-start普通版酸度計測定。

肉色:使用OPTO-start普通版測定。

剪切力:將胸肌放入75℃的水浴鍋中，水浴加熱至中心溫度達到70℃，保持5 min取出，冷卻至室溫，用直徑為1.27 cm的空心取樣器沿肌纖維方向鉆取3個肉柱，然后用C-LM3型嫩度計進行測定，求其平均值。

滴水損失:將修整好的樣品稱重(W0)，懸吊于冰箱冷藏層，保存24 h，取出肉樣，用潔凈濾紙輕輕拭去肉樣表層汁液后稱重(W1)，按該公式計算滴水損失:滴水損失= [(W0-W1)/W0] ×100%。

1.3 引物設計

根據PRKAG3基因的序列(GeneBank登錄號為:DQ280152)，利用軟件Premier 5.0設計引物，擴增片段長度為303 bp。引物由上海生工生物工程技術有限公司合成，上游引物:5'-CCCTCCTCTGTCTCCTTACA-3'，下游引物:5'-AAGGGATGCGCTCCTACCGC-3'。

1.4 目的片段PCR擴增

50 μL 反應體系:基因組 DNA2.0 μL(約50 ng)，上游引物(10 pmol·μL-1)1.0 μL，下游引物 (10 pmol· μL-1)1.0 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol/L)4.0 μL，10 ×PCR Buffer5.0 μL，ExTaq DNA 聚合酶(1U·μL-1)0.5 μL，滅菌水 36.5 μL。擴增條件為:94℃預變性4 min，94℃變性30 s，63℃退火45 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)，72℃延伸10 min。擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 PCR產物的SSCP分析

2 μL PCR 產物與5 μL 變性 Buffer混勻，98℃變性10 min，迅速冰浴5 min，用微量注射器將變性樣品點于11%PAGE中，150 V電泳14 h;取下凝膠，置于70%乙醇中，輕搖10～15 min，雙蒸水洗膠3次，將凝膠置于染色液中，輕搖約30 min，去染色液，雙蒸水洗膠3次，顯色液顯色至條帶清晰出現，用雙蒸水沖洗以終止反應。

1.6 數據統(tǒng)計分析

本研究所用蘆花雞的年齡、性別以及飼料等試驗條件一致，數據采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計，差異顯著用ONE-WAY ANOVA方差分析，進行Duncan's LSD檢驗。

2 結果

2.1 PCR擴增結果

擴增產物經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，可看到一條大小為303 bp的片段，目的片段明亮、特異性好，可進行SSCP分析。

圖1 PRKAG3基因PCR產物電泳圖

2.2 PCR-SSCP檢測結果

PCR產物經10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，結果出現3種基因型:TT、TG和GG(如圖2)。由圖2中可以推斷出，該位點由1對等位基因控制(分別命名為等位基因T和G)。

圖2 PRKAG3基因PCR-SSCP凝膠電泳圖

2.3 測序結果

將測序結果與GeneBank上序列(登錄號:DQ280152)進行同源性分析，結果發(fā)現TT型的序列與GeneBank中的序列相同，定義為野生型，GG型第2832位的T突變?yōu)镚，定義為突變型。兩個純合基因型的測序結果見圖3。

圖3 TT和GG基因型的測序峰圖

2.4 基因頻率與基因型頻率

檢測結果發(fā)現，蘆花雞PRKAG3基因TG基因型的頻率最高，其次是TT型和GG型(如表1)。等位基因T和G的頻率分別為0.747和0.253，等位基因T在群體中占優(yōu)勢。適合性X2檢驗結果表明，蘆花雞(X2=0.1412，P＞0.05)群體 PRKAG3基因第11外顯子處于Hardy-Weiberg遺傳平衡狀態(tài)。

表1 蘆花雞PRKAG3基因的基因型和等位基因頻率

2.5 PRKAG3不同基因型與蘆花雞肉質性狀的相關性分析

將PRKAG3基因多態(tài)位點與蘆花雞肉質性狀進行最小二乘分析，結果顯示PRKAG3不同基因型對pH值有顯著影響，如表2所示。pH值為GG型極顯著低于TG型和TT型(P＜0.01)，而TG型顯著低于TT型(P＜0.05);其它肉質性狀在不同基因型間差異不顯著。

表2 蘆花雞PRKAG3基因不同基因型的肉質性狀的最小二乘分析

3 討論與結論

在生命科學的研究領域里，對動物生長發(fā)育的研究是一個永恒的課題，揭示動物生長發(fā)育規(guī)律和實現對動物生長發(fā)育的調控一直是人類美好的愿望。肉質性狀一直是消費者和生產者共同關心的問題，是近年遺傳育種學家研究的熱點和難點。隨著育種學及分子生物學的飛速發(fā)展，動物育種工作已取得了前所未有的進步。

肉質性狀包括胴體組成和肌肉品質兩大部分，為典型的數量性狀，其遺傳力大都在0.15～0.30之間，其中有關胴體組成的部分肉質性狀具有較高的遺傳力，有的可高達0.50左右。大量研究表明，PRKAG3基因可作為一個影響肉質性狀的候選基因，存在較高的變異頻率。Matthieu在總長8 048 bp的cds上共發(fā)現32個SNPs位點，平均每250 bp就存在1個SNP，有5個突變使氨基酸發(fā)生 了 改 變[6]。 李 靜 等[7]對 延 邊 黃 牛 的PRKAG3基因的多態(tài)性進行了分析，發(fā)現PRKAG3基因第10外顯子存在C4738T突變，且不同基因型所對應的嫩度、肉色(24h紅色度與黃色度)、油酸、亞麻酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、丙氨酸、纈氨酸和脯氨酸存在一定的相關性。李武峰等[8]對7個品種牛的PRKAG3基因的多態(tài)性進行了分析，發(fā)現 PRKAG3基因第4內含子存在T2643C和T2885C兩處突變，且不同基因型所對應的嫩度性狀存在顯著差異。在PRKAG3基因中發(fā)現的一個單堿基突變(R200Q)解釋了RN-性狀的顯性變異，這個R200Q突變導致RN-/RN-和RN-/rn+動物的肌肉糖原含量提高了70%，豬被屠宰之后24h測定肌肉的pH值較低，肌肉系水力下降，烤制火腿的產量也降低。這個R200Q等位位點與所有RN-型動物有關，并在漢普夏品種中有很高的比例，但不存在于 rn+ 基因型或其它品種豬中[9，10]。而I199V對幾乎所有研究的性狀都有極顯著的效應，不僅包括糖原、乳酸、糖酵解潛能這些指標，還有一些與之相關的其他肉質性狀[11]。發(fā)生在豬γ3亞基V224I的變異，進一步證明了γ3亞基變異對骨骼肌糖原內含物和全部的肌肉生化內含物的作用，它與在糖原內含物以及乳酸內含物和糖酵解潛能的減少相關[12]。

近年來，經濟性狀功能基因的多態(tài)性研究，已成為動物遺傳育種研究的熱點之一。標記輔助選擇(MAS)是目前研究最多的方法，它是將現代分子生物學技術與常規(guī)育種方法相結合，借助分子標記選擇某一位點基因改變該位點基因頻率的過程，也稱分子輔助選擇。當前，國內外對PRKAG3基因的研究主要集中在它與豬的肉質性狀的關聯分析上，而對雞的肉質性狀的研究相對較少。本研究采用PCR-SSCP檢測了蘆花雞PRKAG3基因的外顯子11的遺傳多態(tài)性，結果顯示PRKAG3不同基因型對pH值有顯著影響，其它肉質性狀在不同基因型間差異不顯著。由此證明，PRKAG3基因有可能成為對蘆花雞肉質性狀產生影響的候選基因，可作為選育蘆花雞肉質性狀的分子標記，用于標記輔助選擇意義重大。

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