恭 燁 ，洪厚成 ，李潤(rùn)成 ，※，賀名葉 ，錢 幸 ，余興龍

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.湖南省平江縣三陽(yáng)鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)水產(chǎn)站，湖南平江 414500）

2011年5月份湖南某豬場(chǎng)發(fā)生疫情，根據(jù)獸醫(yī)對(duì)該場(chǎng)發(fā)病情況的描述得知，一個(gè)月內(nèi)此豬場(chǎng)陸續(xù)出現(xiàn)30～40日齡斷奶仔豬四肢關(guān)節(jié)腫大，跛行，嚴(yán)重時(shí)后肢癱瘓不能行走，并伴有體溫升高癥狀，該病起病急、病程短，有的豬突然死亡，發(fā)病斷奶仔豬達(dá)189頭，死亡40頭，發(fā)病率達(dá)50%，病死率達(dá)到20%以上。對(duì)病豬剖檢臟器未見(jiàn)明顯病變。由于該豬場(chǎng)母豬每年免疫2 次鏈球菌疫苗，豬場(chǎng)獸醫(yī)認(rèn)為小豬對(duì)鏈球菌感染應(yīng)該具備一定的抵抗力。因此，懷疑斷奶仔豬為副豬嗜血桿菌感染，送檢了4頭關(guān)節(jié)嚴(yán)重腫大的病死小豬的前后肢進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷，并試圖找到控制疫情的方案。筆者就送檢的斷奶仔豬關(guān)節(jié)進(jìn)行了剖解、涂片鏡檢、細(xì)菌分離鑒定、藥物敏感性試驗(yàn)，并用分離細(xì)菌制備了滅活疫苗，有效的控制了該次疫情?，F(xiàn)報(bào)告如下：

1 材料與方法

1.1 病料

4頭病死小豬腫大的關(guān)節(jié)。

1.2 主要試劑

鮮血瓊脂培養(yǎng)基、巧克力瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自鄭州貝瑞特公司，PCR 試劑購(gòu)自北京天根生化，氫氧化鋁佐劑購(gòu)自SIGMA 公司。

1.3 小豬四肢關(guān)節(jié)的解剖與病變組織涂片鏡檢

用手術(shù)刀切開(kāi)小豬腫大的腿部關(guān)節(jié)，觀察關(guān)節(jié)腔病變并取病變組織觸片后美蘭染色鏡檢。

1.4 細(xì)菌分離培養(yǎng)及PCR 鑒定

1.4.1 用接種環(huán)鉤取關(guān)節(jié)腔內(nèi)病變組織少許，分別劃線接種鮮血瓊脂培養(yǎng)基和巧克力瓊脂培養(yǎng)基。然后將鮮血瓊脂放到37℃恒溫箱培養(yǎng)，巧克力瓊脂放于燭缸后37℃培養(yǎng)，48h 后觀察結(jié)果并取培養(yǎng)物涂片、革蘭氏染色鏡檢。

1.4.2 培養(yǎng)物的PCR 鑒定

（1）細(xì)菌16S 通用引物的設(shè)計(jì)與合成

參照GeneBank 收錄的不同細(xì)菌16SrRNA 序列。從最保守區(qū)設(shè)計(jì)了一對(duì)革蘭氏陰性和革蘭氏陽(yáng)性菌的通用引物，引物序列為：上游引物：5′-AGYGGCGRACGGGTGAGTAA-3′；下游引物：5′-CCATTGTAGCACGTGTGTAGC-3′。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1041bp

（2）以純培養(yǎng)的細(xì)菌為模板，用設(shè)計(jì)的細(xì)菌16S通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。按常規(guī)方法通過(guò)PCR 反應(yīng)擴(kuò)增菌株的16S rRNA 基因序列，PCR 退火溫度為55℃。

（3）PCR 產(chǎn)物的純化與序列測(cè)定。

PCR 產(chǎn)物的純化按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。將純化的16S rRNA PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送北京華大基因生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序并將測(cè)出的序列進(jìn)行Blast 分析確定細(xì)菌的種類。

1.5 分離細(xì)菌的藥物敏感性試驗(yàn)

從固體培養(yǎng)基上挑取菌落接種血清肉湯培養(yǎng)基37℃震蕩培養(yǎng)24h，然后用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥物敏感性實(shí)驗(yàn)。具體操作按常規(guī)進(jìn)行。

1.6 細(xì)菌滅活疫苗的制備

1.6.1 挑取鑒定后的細(xì)菌菌落接種血清肉湯培養(yǎng)基600 mL，37℃震蕩培養(yǎng)24h 后進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。記數(shù)方法采用平板法，具體操作按常規(guī)進(jìn)行。

1.6.2 取甲醛加入細(xì)菌培養(yǎng)液中直至甲醛濃度達(dá)到0.4%左右，然后將菌液放于37℃溫箱滅活并每8h搖勻菌液1 次，48h 后挑取少量菌液接種鮮血瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)48h 后檢測(cè)細(xì)菌滅活效果。

1.6.3 于滅活后的600mL 菌液中緩慢加入氫氧化鋁佐劑，邊加邊進(jìn)行震蕩混勻，直至加完70mL 鋁佐劑后再震蕩20min，分裝到滅菌的50mL 塑料瓶中，封口壓蓋，4℃保存。

1.6.4 隨機(jī)挑取制備好的細(xì)菌疫苗3 瓶進(jìn)行小鼠接種試驗(yàn)，0.5mL/鼠，共接種小鼠18 只。同時(shí)用少量疫苗接種鮮血瓊脂和巧克力瓊脂平板。分別采取有氧和厭氧培養(yǎng)，進(jìn)行疫苗安全性評(píng)價(jià)。

1.7 滅活疫苗的臨床應(yīng)用

取制備的細(xì)菌疫苗接種生豬，母豬免疫2mL/頭，15日齡的小豬免疫0.5mL/頭。

2 結(jié)果

2.1 病料鏡檢

用手術(shù)刀切開(kāi)小豬腫大的腿部關(guān)節(jié)（圖1），觀察關(guān)節(jié)腔病變并取病變組織觸片后美蘭染色鏡檢。關(guān)節(jié)腔病變見(jiàn)圖2，由圖2 可見(jiàn)關(guān)節(jié)外部的骨間韌帶出現(xiàn)了化膿性病變。病變組織涂片鏡檢可看到成鏈的球狀細(xì)菌。

2.2 分離培養(yǎng)

用關(guān)節(jié)腔內(nèi)病變組織接種鮮血瓊脂培養(yǎng)基和巧克力瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)48h 后觀察細(xì)菌生長(zhǎng)形態(tài)。結(jié)果兩種培養(yǎng)基均長(zhǎng)出了相同形態(tài)的很純的細(xì)菌。細(xì)菌菌落成透明的水滴狀，鮮血瓊脂培養(yǎng)基上有明顯的β溶血特性；挑取菌落涂片、革蘭氏染色鏡檢，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3 可見(jiàn)大量革蘭氏陽(yáng)性、呈短鏈狀的球狀細(xì)菌。

2.3 培養(yǎng)物的PCR 鑒定結(jié)果

以純培養(yǎng)的細(xì)菌為模板，用設(shè)計(jì)的細(xì)菌16S rRNA 通用引物擴(kuò)增分離菌株的16S rRNA 基因序列，結(jié)果見(jiàn)圖4，由圖4 可見(jiàn)擴(kuò)增出了預(yù)期大小的條帶(1、2：分離菌，M：DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)，3：陰性對(duì)照)。

PCR 產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果通過(guò)編輯后共得到778bp的準(zhǔn)確序列。用序列進(jìn)行BLAST 分析確定該細(xì)菌為馬鏈球菌獸疫亞種。

2.4 分離細(xì)菌藥物敏感性試驗(yàn)

從固體培養(yǎng)基上挑取菌落接種血清肉湯經(jīng)12h 培養(yǎng)后用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥物敏感性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見(jiàn)表1。由表1 可見(jiàn)該菌對(duì)頭孢類藥物比較敏感。豬場(chǎng)方采用頭孢類藥物進(jìn)行治療，對(duì)于早中期病例同樣也取得了很好的效果。

2.5 細(xì)菌滅活疫苗的制備

2.5.1 配苗用菌液細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果

挑取分離菌37℃震蕩培養(yǎng)24h 后進(jìn)行細(xì)菌記數(shù)，結(jié)果表明細(xì)菌培養(yǎng)液細(xì)菌濃度為5 ×1010CFU/mL

2.5.2 菌液滅活效果檢驗(yàn)結(jié)果

取出經(jīng)甲醛滅活的培養(yǎng)液，挑取少量接種血平板，37℃培養(yǎng)檢測(cè)滅活效果。結(jié)果經(jīng)48h 培養(yǎng)后，血平板沒(méi)有任何細(xì)菌生長(zhǎng)，表明鏈球菌均已滅活完全。

2.5.3 疫苗成品的安全性檢驗(yàn)

將600mL 菌液中緩慢加入氫氧化鋁佐劑配制成滅活疫苗，分裝到滅菌的塑料瓶中并封口壓蓋。最后隨機(jī)抽取其中3 瓶接種小鼠，同時(shí)用少量疫苗接種細(xì)菌培養(yǎng)基。結(jié)果接種疫苗的小鼠經(jīng)觀察7天沒(méi)有任何異常反應(yīng)；培養(yǎng)基平板上也沒(méi)有細(xì)菌生長(zhǎng)。

2.6 臨床應(yīng)用結(jié)果

母豬免疫2mL/頭，15日齡小豬免疫0.5mL/頭后均沒(méi)有任何不良反應(yīng)。并且經(jīng)接種后該豬場(chǎng)仔豬只有零星豬只出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫大癥狀，但并不嚴(yán)重，經(jīng)治療后既能得到康復(fù)。

3 討論

3.1 馬鏈球菌獸疫亞種為蘭氏分群中的C 群鏈球菌，主要引起豬的鏈球菌病，能引起豬的腦膜炎、敗血癥、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、肺炎以及突發(fā)性死亡[1]，危害集約化養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，不僅給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成較大的危害，同時(shí)對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的相關(guān)從業(yè)人員的健康具有潛在威脅。流行病學(xué)調(diào)查表明，除新出現(xiàn)的豬鏈球菌2 型外，馬鏈球菌獸疫亞種仍是我國(guó)各地豬鏈球菌病的主要病原[2]。

3.2 本文對(duì)發(fā)病豬場(chǎng)30～40日齡斷奶仔豬疫病進(jìn)行了診斷與鑒定，最后確診病豬為馬鏈球菌獸疫亞種感染，對(duì)于此類疾病的診斷提供一定的參考價(jià)值。該場(chǎng)母豬雖然接種了鏈球菌疫苗，但30日齡斷奶仔豬可能已沒(méi)有母源抗體保護(hù)或母源抗體滴度低、保護(hù)性不強(qiáng)，而剛斷奶仔豬母源抗體含量高有較強(qiáng)的保護(hù)性故不發(fā)病，亦或者母豬接種的疫苗菌株對(duì)該菌的交叉保護(hù)性不夠，因而斷奶仔豬感染了該鏈球菌并表現(xiàn)出發(fā)病。

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3.3 由細(xì)菌鑒定結(jié)果可見(jiàn)該分離菌能引起斷奶仔豬少見(jiàn)的關(guān)節(jié)韌帶呈化膿性變化，多數(shù)病例以關(guān)節(jié)滲出、腫脹多見(jiàn)；在鮮血瓊脂平板上為透明水滴狀，有溶血特性的菌落，而非半透明菌落，這些臨床致病表現(xiàn)和細(xì)菌生長(zhǎng)特性方面與王繼春鑒定的馬鏈球菌獸疫亞種9802 株[3]存在一定的不同之處，本文通過(guò)培養(yǎng)分離菌制備滅活疫苗接種母豬和哺乳仔豬成功控制了病例的不斷出現(xiàn)，這對(duì)指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)踐具備一定的參考價(jià)值，特別是對(duì)于病原細(xì)菌血清型較多、相互間交叉免疫性不夠的情況下，如：馬鏈球菌馬亞種，A、D 群鏈球菌與馬鏈球菌獸疫亞種則基本上沒(méi)有交叉保護(hù)性[4]，用市場(chǎng)上通用的疫苗難以控制疾病時(shí)，通過(guò)分離本場(chǎng)的病原菌制備滅活疫苗來(lái)控制疫情能起到很好的輔助作用。 □

[1] 陸承平.獸醫(yī)微生物學(xué)(第三版)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2001：204～212.

[2] 姚火春,陳國(guó)強(qiáng),陸承平.豬鏈球菌1998 分離株病原特性鑒定[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1999,22(2)：67～70.

[3] 王繼春,何家惠.豬鏈球菌2 型與馬鏈球菌獸疫亞種生物學(xué)特性的初步比較[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào).2000,22（SI）：66～68.

[4] 范紅結(jié),陸承平.豬源馬鏈球菌獸疫亞種滅活疫苗對(duì)小鼠的免疫效力評(píng)價(jià)[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué).2008,41(2)：613～618.