陳招娣,李潤(rùn)成*,蔣大良,余興龍
(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,湖南長(zhǎng)沙 410128)
豬細(xì)小病毒病是由豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus,PPV)引起,以母豬特別是初產(chǎn)母豬繁殖障礙為特征的一種病毒性疾病。該病能導(dǎo)致母豬不孕、流產(chǎn)、產(chǎn)木乃伊胎、畸胎或死胎、新生仔豬死亡,還能導(dǎo)致仔豬皮炎、腹瀉等。
2011年4月,湖南某規(guī)模豬場(chǎng)飼養(yǎng)的160頭母豬中60頭初產(chǎn)母豬,陸續(xù)表現(xiàn)流產(chǎn),產(chǎn)死胎,木乃伊胎等。筆者對(duì)該場(chǎng)的母豬抽樣采血并進(jìn)行了豬瘟病毒抗體、藍(lán)耳病毒抗體以及偽狂犬的野毒抗體的檢測(cè)。此外還對(duì)流產(chǎn)死胎進(jìn)行了豬細(xì)小病毒的病原學(xué)檢測(cè)?,F(xiàn)報(bào)告如下:
1.1 病料樣品
21 份母豬血液(1~10 號(hào)來(lái)自經(jīng)產(chǎn)母豬、11~21號(hào)來(lái)自初產(chǎn)母豬),3頭懷孕70天以內(nèi)流產(chǎn)的死胎。
1.2 主要試劑和試劑盒
檢測(cè)豬瘟病毒抗體、藍(lán)耳病毒抗體、偽狂犬野毒抗體的ELISA 試劑盒均為美國(guó)IDEXX 公司生產(chǎn),PCR 試劑購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司,瓊脂糖凝膠為鼎國(guó)公司生產(chǎn)。
2.1 血清抗體的檢測(cè) 按試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。
2.2 細(xì)小病毒的PCR 檢測(cè)
?
2.2.1 引物的設(shè)計(jì)和合成
參照GeneBank 上登陸的豬細(xì)小病毒基因序列(參考序列登陸號(hào)為EU790641),設(shè)計(jì)一對(duì)引物,特異性擴(kuò)增196bp 的DNA 片段。引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。
2.2.2 PCR 檢測(cè)
取流產(chǎn)死胎的肝臟、肺臟,研磨成勻漿,按蛋白酶K、酚、氯仿的方法抽提,提取基因組后,用引物Fp1 和Rpl 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增豬細(xì)小病毒特異性片段,PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min;進(jìn)入循環(huán),94℃ 30 s,60℃ 30 s,72℃ 30s,進(jìn)行 35 個(gè)循環(huán);72℃延伸7min。最后用1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
2.2.3 PCR 產(chǎn)物測(cè)序
將PCR 產(chǎn)物用純化試劑盒進(jìn)行清潔純化,純化后的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送北京華大生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序并將測(cè)出的序列進(jìn)行Blast 分析確定。
3.1 血清抗體檢測(cè)結(jié)果
取21 份母豬血清分別進(jìn)行豬瘟病毒抗體(HCV Ab)、藍(lán)耳病毒抗體(PRRSV Ab)、偽狂犬野毒抗體(PRV Ab)3 個(gè)項(xiàng)目的檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2,由表2 可見(jiàn)21 份血清中有14 份為豬瘟抗體陽(yáng)性,其中經(jīng)產(chǎn)母豬的有7 份,初產(chǎn)母豬的有7 份;藍(lán)耳病毒抗體則所有樣本均為陽(yáng)性,21 份樣本中S/P 值均在2.0 以下;所有血清樣品偽狂犬野毒抗體均為陰性。
表2 中,豬瘟抗體判定標(biāo)準(zhǔn):阻斷率≥40%為陽(yáng)性(+),阻斷率≤30%為陰性(-),30% < 阻斷率<40%為可疑(±);藍(lán)耳病毒抗體判定標(biāo)準(zhǔn):S/P值≥0.4 時(shí)為陽(yáng)性(+),S/P 值 <0.4 時(shí)為陰性(-);偽狂犬野毒抗體判定標(biāo)準(zhǔn):被檢樣品S/N≤0.6 為抗體陽(yáng)性(+);S/N>0.7 為抗體陰性(-);0.6<S/N≤0.7 為可疑(±)。
?
3.2 PCR 檢測(cè)結(jié)果
以提取的豬細(xì)小病毒基因組為模板,用設(shè)計(jì)的豬細(xì)小病毒特異性引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,結(jié)果見(jiàn)圖1,由圖可見(jiàn)3 份病料樣本均擴(kuò)增出與預(yù)期大小相符的片段。
3.3 測(cè)序結(jié)果
PCR 產(chǎn)物純化后送公司進(jìn)行1 個(gè)反應(yīng)的測(cè)序,共得到196bp 的準(zhǔn)確序列,進(jìn)行BLAST 分析發(fā)現(xiàn)該病毒確為豬細(xì)小病毒,序列如下:
GGACCATTAACAGCACTAAACAATACTGCACCTG TATTTCCAAATGGTCAAATATGGGATAAAGAACT TGATACAGATCTAAAACCTAGACTACATGTTACA GCTCCATTTGTTTGTAAAAACAATCCACCAGGAC AACTATTTGTAAAAATAGCACCAAACCTAACAG ATGATTTCAATGCTGACTCTCCTCAAC
4.1 疫情診斷
該母豬群豬瘟抗體陽(yáng)性率66.67%,陰性率28.57%,可疑率4.76%;藍(lán)耳病毒抗體陽(yáng)性率為100%,且抗體水平S/P 值均在0.4~2.0 之間;偽狂犬野毒抗體均為陰性。從檢測(cè)結(jié)果可見(jiàn)該母豬群豬瘟抗體水平不理想,但由于表現(xiàn)流產(chǎn)、產(chǎn)木乃伊胎的初產(chǎn)母豬有半數(shù)以上豬瘟抗體水平較好,抗體阻斷率值在60%以上,因此可以推斷該次疫情不是由豬瘟病毒引起,此外,母豬群藍(lán)耳病毒抗體均為陽(yáng)性且抗體水平比較整齊,目前該豬場(chǎng)應(yīng)該不屬于藍(lán)耳病毒感染活躍豬群;偽狂犬野毒抗體均為陰性,表明豬群中沒(méi)有偽狂犬野毒感染和流行。
取流產(chǎn)死胎進(jìn)行豬細(xì)小病毒的PCR 檢測(cè)并測(cè)序,結(jié)果表明在樣本中均能檢測(cè)到細(xì)小病毒基因,結(jié)合臨床癥狀可將該場(chǎng)出現(xiàn)的初產(chǎn)母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、木乃伊胎確診為細(xì)小病毒感染造成。
4.2 豬場(chǎng)細(xì)小病毒病的防控
豬細(xì)小病毒病是導(dǎo)致母豬特別是初產(chǎn)母豬繁殖障礙的疾病之一,隨著規(guī)?;B(yǎng)殖的發(fā)展,母豬的健康和產(chǎn)仔率、仔豬成活率越來(lái)越成為養(yǎng)殖業(yè)的關(guān)鍵。筆者認(rèn)為,對(duì)于豬細(xì)小病毒病的防控應(yīng)做到以下幾點(diǎn):一是引種要規(guī)范,杜絕引進(jìn)病豬和帶毒豬;二是初產(chǎn)母豬要主動(dòng)免疫后才能配種,后備公豬在配種前一個(gè)月應(yīng)進(jìn)行免疫接種;三是要建立規(guī)范、科學(xué)的免疫程序,定期進(jìn)行血清學(xué)監(jiān)測(cè)及時(shí)了解豬群免疫狀況;四是應(yīng)建立高標(biāo)準(zhǔn)的衛(wèi)生防疫和綜合防制措施,杜絕病毒的傳播和污染,促進(jìn)豬場(chǎng)健康發(fā)展。 □