肖 毅,何 娟,黃紅梅,李 莎

(化學(xué)生物學(xué)及中藥分析教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖南長沙410081)

0 引言

共軛聚合物作為一種具有π-π*共軛分子導(dǎo)線結(jié)構(gòu)和顯著放大效應(yīng)的新型熒光探針，在化學(xué)和生物傳感研究方面倍受矚目[1]。共軛聚電解質(zhì)把共軛聚合物的光電性質(zhì)和聚電解質(zhì)的水溶性結(jié)合起來,具有檢測簡便、靈敏度高、響應(yīng)快和適用范圍廣等特點(diǎn)，可用于水環(huán)境以及生命體系中的傳感檢測，并可進(jìn)一步提高對于帶有相反電荷猝滅劑檢測的靈敏度。近年來，共軛聚電解質(zhì)已被廣泛用于蛋白質(zhì)[2～3]、DNA[4]、糖類[5]等生物分子以及水環(huán)境中金屬離子[6]的檢測。

小檗堿是重要的季銨類生物堿，具有顯著的抗微生物活性[7]，已廣泛用于治療細(xì)菌性痢疾，腸內(nèi)寄生蟲感染和沙眼感染。此外，小檗堿還具有抗腫瘤和抗糖尿病的療效[8～9]。目前已報(bào)道的用于定量檢測小檗堿的方法主要有熒光分析法[10]、分光光度法[11]、電化學(xué)法[12]及高效液相色譜法[13]等。其中熒光分析法具有快速、靈敏、選擇性好的優(yōu)點(diǎn)，但基于共軛聚電解質(zhì)的熒光分析法用于小檗堿等藥物的定量檢測還很少有報(bào)道。

該文首次以含磺酸根側(cè)鏈的PPE類共軛聚電解質(zhì)PPESO3作為探針，基于陰離子磺酸側(cè)鏈與小檗堿季銨陽離子的靜電相互作用，PPESO3的熒光可被小檗堿顯著猝滅，從而建立了高靈敏檢測小檗堿的新方法。這為進(jìn)一步拓展共軛聚合物在藥物方面的監(jiān)測奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為研究藥物與大分子之間的相互作用提供了借鑒。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

熒光光譜在F-4500熒光光譜儀（日立）上測定；紫外可見光譜在UV-2450紫外可見分光光度計(jì)（日本島津）上測定；1H NMR在核磁共振儀Bruker DMX 500上測定,DMSO-d6為溶劑。

PPESO3配成 2.54×10-4mol/L 的儲備液 （濃度以重復(fù)單元計(jì)）；小檗堿（購于湖南省藥檢所）配成2.53×10-3mol/L的儲備液；所有的試劑均為市售分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。 pH=1.00～9.00的檸檬酸-磷酸氫二鈉(H3Cit-Na2HPO4)緩沖體系用 0.1 mol/L檸檬酸和 0.2 mol/L磷酸氫二鈉配制，pH ＜ 2.20，pH ＞ 8.00 的緩沖溶液分別用鹽酸和氫氧化鈉調(diào)節(jié)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PPESO3的合成

參照文獻(xiàn)[14～15]方法通過Sonogashira偶聯(lián)反應(yīng)合成PPESO3、P1，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖 1所示，并通過核磁共振、紅外等對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了確認(rèn)。

圖1 PPESO3,P1的結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 The structures of PPESO3and P1

1.2.2 熒光光譜

PPESO3儲備液用緩沖液稀釋至 5.0×10-6mol/L，取2 mL置于比色皿中，檢測其熒光強(qiáng)度I0(λex/em=438/533 nm)。加入不同濃度小檗堿溶液(體積小于10 μL)，穩(wěn)定后檢測熒光強(qiáng)度I。以I0/I衡量其對PPESO3的熒光猝滅效率。P1(λex/em=401/424 nm)與小檗堿的作用采用上述同樣的步驟進(jìn)行分析。

1.2.3 紫外吸收光譜

用緩沖液將PPESO3儲備液稀釋至3.0×10-5mol/L，取2 mL底液置于比色皿中，加入不同濃度的小檗堿(體積小于10 μL)，測量混合溶液的紫外吸收光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 PPESO3對小檗堿的熒光響應(yīng)

圖2考察了PPESO3對小檗堿的響應(yīng)。從圖可以看出，隨著小檗堿濃度增加，PPESO3的熒光強(qiáng)度顯著下降，而其最大發(fā)射峰位置沒有發(fā)生改變。進(jìn)一步地研究可知，小檗堿的濃度在7.5×10-8mol/L～4.0×10-6mol/L 范圍內(nèi)與 PPESO3的熒光猝滅程度I0/I呈良好的線性關(guān)系，檢出限達(dá)到8.7×10-9mol/L(S/N=3)， 其相應(yīng)的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)分別為 y=0.426 77+0.017 63x，r=0.997 9， 小檗堿猝滅 PPESO3的 Stern-Volmer常數(shù) KSV為 1.76×107L/mol， 這 說 明 小 檗 堿 與PPESO3有很強(qiáng)的相互作用，這可能與PPESO3的磺酸基陰離子側(cè)鏈與小檗堿的季銨陽離子之間可以通過靜電作用有關(guān)。因此，可以通過測定PPESO3的熒光猝滅程度來定量檢測小檗堿。

2.2 離子側(cè)鏈對小檗堿的熒光響應(yīng)影響

為了證實(shí)側(cè)鏈電荷對小檗堿的檢測起主導(dǎo)作用，考察了帶相反電荷側(cè)鏈的共軛聚電解質(zhì)對小檗堿傳感放大性能的影響。圖3給出了季銨根陽離子側(cè)鏈的P1加入小檗堿后引起其熒光猝滅的效率。從圖可以看出，小檗堿猝滅PPESO3(KSV為 1.76×107L/mol)的效率是 P1 的(KSV=3.49×105L/mol)50.4倍。P1具有與PPESO3類似的共軛結(jié)構(gòu)，猝滅效果卻遠(yuǎn)不及PPESO3。這說明PPESO3對小檗堿高靈敏的響應(yīng)主要是由于帶負(fù)電側(cè)鏈磺酸基與生物堿小檗堿的季銨陽離子通過強(qiáng)的靜電相互作用形成復(fù)合物，導(dǎo)致了PPESO3的熒光被顯著地猝滅；而小檗堿即使在高濃度時(shí)對P1的猝滅效果也不明顯，這可能與季銨根側(cè)鏈與小檗堿的季銨陽離子之間存在靜電相互排斥作用使得P1與小檗堿的距離拉遠(yuǎn)，難以相互靠近有關(guān)。

圖2 PPESO3中加入不同濃度的小檗堿后的熒光光譜(λex/em=438/533 nm，pH=2.00)插圖：熒光猝滅效率(I0/I)隨小檗堿濃度變化的工作曲線[PPESO3]=5.0×10-6mol/LFig.2 Fluorescence spectra of PPESO3(5.0×10-6mol/L)with successive addition of berberine at pH2.00 Inset:Plot of the relative fluorescence quenching(I0/I)of PPESO3as a function of different concentration of berberine

圖3 不同濃度的小檗堿猝滅PPESO3，P1溶液的熒光[PPESO3]=[P1]=5.0×10-6mol/LFig.3 The fluorescence quenching of PPESO3,P1 by different concentrations of berberine.[PPESO3]=[P1]=5.0×10-6mol/L

2.3 小檗堿與PPESO3相互作用的紫外-可見光譜

圖4 PPESO3加入小檗堿后的紫外-可見吸收光譜圖(pH=2.00的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液)Fig.4 UV-vis absorption spectra of PPESO3in the presence of various concentration of berberine(0,1.0×10-7,3.0×10-7,5.0×10-7,7.0×10-7,1.0×10-6mol/L)in Na2HPO4-H3Cit buffer solution at pH2.00.[PPESO3]=3.0×10-5mol/L

小檗堿與PPESO3作用的紫外-可見吸收光譜見圖4，從圖中可以看出，PPESO3在416 nm處存在特征吸收峰，隨著小檗堿的加入，特征吸收峰發(fā)生減色效應(yīng)，同時(shí)伴隨著輕微紅移，說明了小檗堿與含磺酸側(cè)鏈的陰離子共軛聚電解質(zhì)PPESO3發(fā)生了相互作用。而含季銨陽離子側(cè)鏈的P1在加入小檗堿后，特征吸收峰并未發(fā)生紅移現(xiàn)象，說明靜電作用在小檗堿與PPESO3的相互作用中占主導(dǎo)地位。

2.4 pH對小檗堿猝滅PPESO3熒光的影響

圖5 不同pH檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液中小檗堿對PPESO3的熒光猝滅Fig.5 The effect of pH on the PPESO3(5.0×10-6mol/L)fluorescence quenching(I0/I)by berberine(1.4×10-7mol/L)in H3Cit-Na2HPO4buffer solution

圖5考察了pH對小檗堿猝滅PPESO3的熒光效率的影響。從圖中可以看出，當(dāng)pH＞2.00時(shí)，隨著pH的增加，熒光猝滅效率逐漸下降，這可能是由于緩沖溶液中的陰離子競爭性地與小檗堿的季銨陽離子發(fā)生靜電相互作用，從而導(dǎo)致了PPESO3與小檗堿之間的作用減弱。而當(dāng)pH＜2.00時(shí)，小檗堿對PPESO3的熒光猝滅影響不大，略有降低。以下實(shí)驗(yàn)選擇pH=2.00進(jìn)行。

2.5 反應(yīng)時(shí)間的考察

在 H3Cit-Na2HPO4(pH=2.00)緩沖溶液中，考察PPESO3/小檗堿相互作用達(dá)到穩(wěn)定所需要的時(shí)間。結(jié)果表明，體系達(dá)到穩(wěn)定所需要的時(shí)間在1～2 min之內(nèi)，PPESO3作為探針可實(shí)現(xiàn)對小檗堿的快速檢測。

2.6 干擾檢測

為了評價(jià)該方法對小檗堿檢測的選擇性，考察了金屬離子、氨基酸和維生素等對小檗堿檢測的影響。在pH=2.00的H3Cit-Na2HPO4緩沖溶液中，PPESO3濃度為 5.0×10-6mol/L，小檗堿濃度為1.4×10-7mol/L，加入干擾物后的相對誤差如表1所示。結(jié)果表明，大部分外來物質(zhì)，如常見的金屬離子Li+、Mg2+,氨基酸GSH和維生素C等在很高的濃度水平而對PPESO3的小檗堿檢測影響不大。然而，一些重金屬離子，如Cu2+、Pb2+對檢測的干擾較大，能容忍的濃度水平較低。與小檗堿具有類似結(jié)構(gòu)的生物堿對PPESO3的熒光也具有顯著的猝滅效果，因此，PPESO3可作為水環(huán)境中選擇性檢測生物堿的熒光探針。

表1 干擾物對PPESO3檢測小檗堿的影響Tab.1 Effect of interferences on the detection of berberine

3 結(jié)論

該文利用陰離子型共軛聚電解質(zhì)作為熒光探針，基于其與小檗堿有很強(qiáng)的靜電結(jié)合作用引起了共軛聚電解質(zhì)熒光顯著地猝滅，發(fā)展了一種簡便、快速、高靈敏度地檢測小檗堿的新方法。結(jié)果表明，在優(yōu)化條件下，采用該方法檢測小檗堿的線性范圍為 7.5×10-8mol/L～4.0×10-6mol/L，檢出限為8.7×10-9mol/L(S/N=3)。該方法拓展了共軛聚合物在藥物方面的檢測應(yīng)用，并為探究藥物與大分子之間的相互作用提供了可能的途徑。

[1]Thomas S W,Joly D G,Swager T M.Chemical sensors based on amplifying fluorescent conjugated polymers[J].Chem.Rev.,2007,107:1 339～1 386.

[2]Feng X,Liu L,Wang S,et al.Water-soluble fluorescent conjugated polymers and their interactions with biomacromolecules for sensitive biosensors[J].Chem.Soc.Rev,2010,39(7):2 411～2 419.

[3]Aberem M B,Najari A,Ho H A,et al.Protein detecting arrays based on cationic polythiophene-DNA-aptamer complexes[J].Adv.Mater.,2006,18:2 703～2 707.

[4]Brouard D,Viger M L,Bracamonte A G,et al.Label-free biosensing based on multilayer fluorescent nanocomposites and a cationic polymeric transducer[J].ACS Nano,2011,5(3):1 888～1 896.

[5]DiCesare N,Pinto M R,Schanze K S,et al.Saccharide detection based on the amplified fluorescence quenching of a water-soluble poly(phenylene ethynylene)by a boronic acid functionalized benzyl viologen derivative[J].Langmuir,2002,18(21):7 785～7 787.

[6]Hu Y Q,Xiao Y,Huang H M,et al.An anion-conjugated polyelectrolyte designed for the selective and sensitive detection of silver(I)[J].Chem.Asian J.,2011,6:1 500～1 504.

[7]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典 (一部)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005,214.

[8]Fukuda K,Hibiya Y,Mutoh M,et al.Inhibition by berberine of cyclooxygenase-2 transcriptional activity in human colon cancer cells[J].J Ethnopharmacol,1999,66(2):227～233.

[9]Chueh W H,Lin J Y.Berberine,an Isoquinoline Alkaloid in Herbal Plants,Protects Pancreatic Islets and Serum Lipids in Nonobese Diabetic Mice[J].J.Agric.Food Chem,2011,59(14):8 021～8 027.

[10]Cao M,Liu M G,Cao C,et al.A simple fluorescence quenching method for berberine determination using water-soluble CdTe quantum dots as probes[J].Spectrochimica Acta Part A,2010,75:1 043～1 046.

[11]Sakai T.Spectrophotometric determination oftrace amounts of quaternary ammonium salts in drugs by ionpair extraction with bromophenol blue and quinine[J].Analyst,1983,108:608～614.

[12]洪如.小檗堿的電化學(xué)行為研究[J].化學(xué)工程與裝備,2010,(7):26～27.

[13]郭錦明,王躍飛,胡麗萍.黃連生物堿的HPLC-MS分析 [J].中成藥,2011,33(1):110～113.

[14]張濤,范宏亮,周建光,等.重要傳感材料熒光共軛聚合物PPESO3的一種新的簡便合成路線[J].高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào),2006,27(5):853～855.

[15]Pu K Y,Pan S Y H,Liu B.Optimization of interactions between a cationic conjugated polymerand chromophore-labeled DNA for optical amplification of fluorescent sensors[J].J.Phys.Chem.B,2008,112(31):9 295～9 300.