蘇有明，李海濤，祝 賀，任冬梅，宋克敏，楊蓉婭

局限性硬皮病的病因至今尚未完全明了，有研究認(rèn)為與機(jī)體免疫功能相關(guān)[1-4]。為探討炎癥免疫相關(guān)細(xì)胞因子在限局性硬皮病中的意義，我們對39例局限性硬皮病患者外周血T淋巴細(xì)胞及血清可溶性白介素2α受體（sIL-2R）和腫瘤壞死因子（TNF）-α進(jìn)行檢測，以探討其在發(fā)病中的作用。

1 資料和方法

1.1 研究資料

39例局限性硬皮病患者為我院皮膚科門診及住院患者，均符合局限性硬皮病診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)組織病理檢查確診。其中斑塊狀硬皮病16例，點(diǎn)滴狀硬皮病7例，線狀或帶狀硬皮病13例，泛發(fā)性硬皮病3例。男27例，女12例，年齡6～45歲。依據(jù)臨床表現(xiàn)分為活動(dòng)期21例、非活動(dòng)期18例（活動(dòng)期硬皮?。浩p逐漸擴(kuò)大，反復(fù)出現(xiàn)新皮損，有紫紅色斑，逐漸變硬，表面光滑發(fā)亮，毛細(xì)血管擴(kuò)張；非活動(dòng)期硬皮?。翰〕蹋?年，沒有新皮損出現(xiàn)，舊皮損大小無改變，皮損變軟呈棕色）。對照組為39名健康獻(xiàn)血者，男24例，女15例，年齡26～48歲。所有入組者檢測前均未使用過糖皮質(zhì)激素和免疫調(diào)節(jié)劑。限局性硬皮病組和對照組均無菌抽取靜脈血2 ml，分別合并并分離血清，于-30℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。同時(shí)實(shí)驗(yàn)當(dāng)場分別取兩組入組者靜脈血4 ml。

1.2 器材與試劑

DMEM培 養(yǎng) 基（美 國 SER-VA）、PHA（美 國Sigma公司）、淋巴細(xì)胞分液Ficoli（上海試劑廠）；T細(xì)胞亞群、TNF-α測定試劑盒（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院）；血清sIL-2R測定藥盒（吉林大學(xué)醫(yī)學(xué)部）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 T淋巴細(xì)胞增殖測定 對照組和局限性硬皮病患者靜脈血4 ml，經(jīng)肝素抗凝，加入1∶50、1∶250、1∶1 250、1∶2 500、1∶5 000 倍量淋巴細(xì)胞分離液，離心，獲取外周血淋巴細(xì)胞（PBMC），經(jīng)Hanks液洗滌3次，用DMEM培養(yǎng)基將PBMC濃度調(diào)整為5×1012個(gè)/L的細(xì)胞懸液。將24孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔加入PBMC 0.1 ml、DMEM 1 ml、PHA 50 μg、硬皮病患者血清0.1 ml；上述培養(yǎng)體系中將硬皮病患者血清改為對照1組血清0.1 ml，重復(fù)上述步驟操作 ；空白對照以DMEM補(bǔ)充至容量。置于5.0%二氧化碳培養(yǎng)箱、37℃培養(yǎng)72 h。離心涂片，瑞氏染色，鏡檢200個(gè)細(xì)胞，按下列公式計(jì)算淋巴細(xì)胞增殖率 ：淋巴增殖率（%）=（患者血清增殖率-患者血清自然增殖率）/（非患者血清增殖率-患者血清自然增殖率）×100%

1.3.2 血清sIL-2R、TGF-α的測定 采用單克隆與多克隆雙抗體夾心法，按試劑盒說明書操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 局限性硬皮病患者血清對淋巴細(xì)胞增殖的影響

無論是局限性硬皮病組或健康對照組的PBMC，加入局限性硬皮病患者血清標(biāo)本后，淋巴細(xì)胞增殖率明顯低于加入正常對照組血清的標(biāo)本和空白對照組，組間和組內(nèi)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（表1）。

表1 不同來源血清對淋巴細(xì)胞增殖率的影響 （±SD，%）

表1 不同來源血清對淋巴細(xì)胞增殖率的影響 （±SD，%）

淋巴細(xì)胞來源例數(shù)空白對照正常對照血清患者血清患者組 39 41.37±4.89 37.15±2.58 26.56±3.83對照組 39 68.27±3.36 66.89±3.84 42.38±4.44

表2 不同稀釋度患者血清對淋巴細(xì)胞增殖率的影響 （±SD，%）

表2 不同稀釋度患者血清對淋巴細(xì)胞增殖率的影響 （±SD，%）

細(xì)胞來源 例數(shù) 1∶50 1∶250 1∶1 250 1∶2 500 1∶5 000 未加血清患者組 39 25.61±2.44 29.01±2.33 30.84±3.32 34.07±3.91 37.91±2.25 42.93±4.68對照組 39 35.50±4.05 39.80±4.50 40.09±8.64 48.36±2.65 55.78±4.88 68.24±3.89

2.2 不同稀釋度局限性硬皮病患者血清對淋巴細(xì)胞增殖的影響

不同稀釋度的局限性硬皮病患者血清對局限性硬皮病患者和對照組的淋巴細(xì)胞增殖均有抑制作用（P＜0.05）（表2），且呈劑量依賴關(guān)系，濃度越高，抑制效應(yīng)越強(qiáng)。

2.3 局限性硬皮病患者血清sIL-2R、TNF-α的變化

39例局限性硬皮病患者血清sIL-2R、TNF-α水平明顯高于對照組，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），其中局限性硬皮病活動(dòng)期患者的sIL-2R水平明顯高于正常對照組和非活動(dòng)期的患者（P＜0.01）。

表3 局限性硬皮病患者與對照組TNF-α、sIL-2R水平比較 （ ±SD）

表3 局限性硬皮病患者與對照組TNF-α、sIL-2R水平比較 （ ±SD）

注：與對照組比較，*P＜0.01；與非活動(dòng)期比較，**P＜0.05

組別 例數(shù) sIL-2R TNF-α(U/ml)限局性硬皮病 39 532.4±175.8 2.082 0±0.157 6*活動(dòng)期 21 675.1±230.1**非活動(dòng)期 18 380.5±134.3對照組 39 188.6±45.2 1.108 2±0.025 3

3 討論

局限性硬皮病患者血清中出現(xiàn)的免疫抑制因子是導(dǎo)致機(jī)體免疫功能紊亂及受抑制的主要原因，免疫抑制因子是一類調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的重要細(xì)胞因子，主要來源于T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞[5]，其中CD4(輔助性T細(xì)胞)和CD8(抑制T細(xì)胞)對機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。本研究結(jié)果顯示血清中sIL-2R、TNF-α含量較對照組高，提示本病與免疫功能紊亂有關(guān)。

局限性硬皮病患者血清對正常人淋巴細(xì)胞PHA誘導(dǎo)的增殖活性有顯著抑制作用，此抑制活性呈明顯劑量依賴關(guān)系，即使血清稀釋至1∶5 000倍仍具抑制效應(yīng)，而未加患者血清的淋巴細(xì)胞增殖率，則不具有上述規(guī)律。由于本實(shí)驗(yàn)采用局限性硬皮病患者混合血清，可以稀釋為局限性硬皮病淋巴細(xì)胞在體外脫離了血清后淋巴細(xì)胞增殖率有一定恢復(fù)，而加入局限性硬皮病患者血清后，對局限性硬皮病患者淋巴細(xì)胞的抑制作用重新表現(xiàn)出來。由此表明局限性硬皮病患者血清中的相關(guān)因子在機(jī)體免疫抑制中起著重要作用。

sIL-2R是一種T淋巴細(xì)胞的激活標(biāo)志[4,5]，也可反映某一組織或體液免疫活性狀態(tài)。sIL-2R增高一方面可能競爭性的抑制IL-2使之清除加速，從而抑制T淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)。同時(shí)高水平的sIL-2R還可影響B(tài)淋巴細(xì)胞功能和體液免疫水平，參與免疫損傷的發(fā)生，激活并促進(jìn)細(xì)胞C-myc、C-fos基因表達(dá)，使細(xì)胞增殖，加重局限性硬皮病的過程。TNF-α是參與機(jī)體損傷時(shí)的重要遞質(zhì)，由巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生[6,7]，除參與免疫和炎癥反應(yīng)外，同時(shí)能夠抑制IL-2依賴性的CD4和CD8 T淋巴細(xì)胞的分化。因此，免疫活性細(xì)胞、細(xì)胞因子和調(diào)節(jié)基因的相互作用構(gòu)成了體內(nèi)細(xì)胞生長和分化的復(fù)雜免疫網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。血清sIL-2R、TNF-α水平升高和T淋巴細(xì)胞亞群異常導(dǎo)致了機(jī)體免疫功能紊亂，可能是局限性硬皮病的發(fā)病誘因之一[8-10]。細(xì)胞因子共同作用于局限性硬皮病皮損中，刺激其增殖、增強(qiáng)其活性，使其合成并分泌大量的膠原和纖連蛋白，引起ECM的合成和沉積增加，參與局限性硬皮病纖維化形成過程。

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