魯米諾-鐵氰化鉀流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光體系測(cè)定飲用水中ɑ-茄堿

朱定波，馬 強(qiáng)，燕 廷，滕久委，唐書(shū)澤

（暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東廣州 510632）

魯米諾-鐵氰化鉀流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光體系測(cè)定飲用水中ɑ-茄堿

朱定波，馬 強(qiáng)，燕 廷，滕久委，唐書(shū)澤*

（暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東廣州 510632）

建立一種快速測(cè)定ɑ-茄堿的新方法，利用魯米諾-鐵氰化鉀化學(xué)發(fā)光體系，結(jié)合流動(dòng)注射技術(shù)，對(duì)ɑ-茄堿進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ɑ-茄堿對(duì)魯米諾-鐵氰化鉀體系發(fā)光反應(yīng)有明顯的抑制作用，在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，該方法的線性范圍為8.0×10-4～1.0×10-1mg/mL，檢出限為6.09×10-5mg/mL，RSD為2.1%（n=11）。 該方法具有操作簡(jiǎn)單、自動(dòng)化程度高、成本低廉、容易實(shí)現(xiàn)在線檢測(cè)以及即時(shí)預(yù)警等優(yōu)點(diǎn)，可用于飲用水中ɑ-茄堿的快速檢測(cè)。

魯米諾，鐵氰化鉀，化學(xué)發(fā)光，ɑ-茄堿

馬鈴薯植株和其塊莖中普遍含有一種有異味、有毒的生物堿，通稱為龍葵素、龍葵堿、茄堿、馬鈴薯素等[1]。這種生物堿不是單一成分，而是一類具有糖苷鍵的含氮甾體化合物，主要成分是ɑ-茄堿（ɑsolanine）和ɑ-卡茄堿（ɑ-chaconine），其含量達(dá)到龍葵素總量的95%以上[2]，且ɑ-茄堿在一定范圍內(nèi)變化[3]，據(jù)相關(guān)研究報(bào)道ɑ-茄堿是主要的制毒物質(zhì)[4]，即ɑ-茄堿可以作為龍葵素毒性的一個(gè)指標(biāo)。通常情況下，龍葵素含量較低時(shí)不會(huì)影響食用品質(zhì)，但當(dāng)馬鈴薯因儲(chǔ)藏不當(dāng)、發(fā)芽變綠或腐爛時(shí)，會(huì)導(dǎo)致龍葵素含量大幅度升高，若人畜食用0.2g龍葵素時(shí)即可出現(xiàn)中毒癥狀，嚴(yán)重者會(huì)出現(xiàn)致畸或死亡的危險(xiǎn)[5]。龍葵素的致毒機(jī)理是抑制體內(nèi)的膽堿酯酶的活性，膽堿酯酶催化神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的水解，生成膽堿和乙酸，該酶被抑制失活后，造成乙酰膽堿的積累，膽堿會(huì)使神經(jīng)興奮增強(qiáng)，引起胃腸肌肉痙攣等一系列中毒癥狀[6]。龍葵素中毒已有發(fā)生，2009年長(zhǎng)春東亞經(jīng)貿(mào)新聞就報(bào)道了一起九臺(tái)市慶陽(yáng)中心學(xué)校中小學(xué)生龍葵素中毒事件[7]。雖然飲用水中目前沒(méi)有中毒報(bào)告，但龍葵素容易獲得，其潛在的危害不容忽視。因此，研究建立快速監(jiān)測(cè)飲用水中龍葵素的變化，對(duì)飲用水早期安全預(yù)警具有重要的意義。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于馬鈴薯中ɑ-茄堿的測(cè)定方法主要有稱重法[8]、比色法[9]、薄層色譜掃描法[10]、酶聯(lián)免疫法[11]和高效液相色譜法[12]等。其中稱重法誤差大，比色法、薄層色譜掃描法和酶聯(lián)免疫法前處理過(guò)程比較復(fù)雜，且比色法和薄層色譜掃描法也不能對(duì)ɑ-茄堿進(jìn)行準(zhǔn)確的定量分析。高效液相色譜法成本又較高。近年來(lái)，化學(xué)發(fā)光分析法以其儀器簡(jiǎn)單、靈敏度高、操作方便等優(yōu)點(diǎn)被應(yīng)用到食品、環(huán)境監(jiān)測(cè)和藥物分析等領(lǐng)域[13-15]。用流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法測(cè)定龍葵素中的ɑ-茄堿的研究未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在研究ɑ-茄堿對(duì)魯米諾-鐵氰化鉀發(fā)光體系發(fā)光強(qiáng)度的影響作用，同時(shí)，建立一種簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高的化學(xué)發(fā)光體系，用于飲用水中ɑ-茄堿突然變化的快速監(jiān)測(cè)和早期安全預(yù)警。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

魯米諾儲(chǔ)備液（0.01mol/L） 稱取0.4430g魯米諾（Sigma公司），用25mL 1mol/L氫氧化鈉溶液溶解并定容至250mL棕色容量瓶中，避光放置1周后使用；鐵氰化鉀儲(chǔ)備液（0.01mol/L） 稱取0.3295g鐵氰化鉀，用少量二次水溶解，定容至100mL棕色容量瓶中，避光儲(chǔ)存?zhèn)溆茫花?solanine 上海Sigma試劑公司；硫酸分析純，廣州化學(xué)試劑廠；氫氧化鈉 分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；實(shí)驗(yàn)用水 雙蒸水。

IFIS-C型流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光儀、RFL-1型超微弱化學(xué)發(fā)光/生物發(fā)光檢測(cè)儀 西安瑞邁電子科技有限公司；RF-5301熒光分光光度計(jì) 日本島津公司；PHS-3C數(shù)字式pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；EL104電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；DHG-9145A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；0.1～1mL、0～50μL微量移液槍 德國(guó)BRAND公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 進(jìn)樣方法 按圖1所示連接流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析路徑，a、b、c 3個(gè)流通管道分別插入ɑ-茄堿溶液（樣品）、鐵氰化鉀溶液、魯米諾溶液。魯米諾溶液首先與鐵氰化鉀溶液經(jīng)三通閥V混合反應(yīng)，再和ɑ-茄堿溶液混合，進(jìn)入反應(yīng)池F反應(yīng)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號(hào)，由光電倍增管（PMT檢測(cè)），信號(hào)經(jīng)放大器放大，進(jìn)入計(jì)算機(jī)處理。據(jù)此得到最大且重復(fù)性較好的發(fā)光信號(hào)。

圖1 流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法流程示意圖Fig.1 Schematic diagram of flow-injection chemiluminescence system

1.2.2 熒光光譜分析 應(yīng)用島津RF-5301PC熒光光度計(jì)分別對(duì)魯米諾、魯米諾-鐵氰化鉀混合液、魯米諾-鐵氰化鉀-ɑ-茄堿混合液進(jìn)行熒光光譜分析。

1.2.3 單因素的選取和實(shí)驗(yàn) 選取影響化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的四個(gè)因素：魯米諾濃度、鐵氰化鉀濃度、魯米諾溶液pH、ɑ-茄堿分析液的pH進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，考察各因素對(duì)相對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響。

1.2.4 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有影響的四個(gè)因素，采用L9（34）正交表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（見(jiàn)表1）。

2 結(jié)果與分析

2.1 各溶液發(fā)射光譜圖

從圖2中可以看出：魯米諾的最強(qiáng)發(fā)射波長(zhǎng)點(diǎn)在425nm處，發(fā)光體是3-氨基鄰苯二甲酸根離子的激發(fā)態(tài)。加入鐵氰化鉀后，發(fā)射波長(zhǎng)仍然在425nm處且相對(duì)熒光強(qiáng)度有明顯增強(qiáng)，但發(fā)光體仍是3-氨基鄰苯二甲酸根離子的激發(fā)態(tài)。加入ɑ-茄堿后，ɑ-茄堿首先與鐵氰化鉀發(fā)生配位反應(yīng)，反應(yīng)的絡(luò)合物抑制了魯米諾-鐵氰化鉀的熒光強(qiáng)度。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

圖2 發(fā)射光譜圖Fig.2 Fluorescence spectrum

2.2 單因素對(duì)化學(xué)強(qiáng)度的影響

2.2.1 魯米諾濃度的選擇 魯米諾作為發(fā)光試劑，其濃度大小直接影響化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。本研究考察了在5.0×10-5～1.0×10-3mol/L范圍內(nèi)魯米諾溶液濃度與化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的關(guān)系見(jiàn)圖3。隨著魯米諾溶液濃度的增大，反應(yīng)體系的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度也不斷增大?；趯?shí)驗(yàn)成本和環(huán)境污染等方面的綜合考慮，魯米諾初選濃度為2.0×10-4mol/L。

圖3 魯米諾濃度對(duì)相對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響Fig.3 Effect of luminol concentration on relative luminescence intensity

2.2.2 鐵氰化鉀濃度的選擇 鐵氰化鉀是該發(fā)光體系的氧化劑，其濃度在一定范圍內(nèi)影響化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。在5.0×10-5～1.0×10-3mol/L范圍內(nèi)鐵氰化鉀濃度與化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的關(guān)系見(jiàn)圖4。鐵氰化鉀溶液濃度為4.0×10-4mol/L時(shí)靈敏度較高，相對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度較理想。因此，選擇鐵氰化鉀最佳濃度為4.0×10-4mol/L。

2.2.3 ɑ-茄堿分析液的pH的選擇 ɑ-茄堿分析液的pH對(duì)體系發(fā)光強(qiáng)度影響見(jiàn)圖5。當(dāng)pH為4時(shí)，體系化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度最強(qiáng)，這是由于魯米諾的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)要求在堿性介質(zhì)中進(jìn)行，而在堿性介質(zhì)中ɑ-茄堿會(huì)沉淀，因此必須保證足夠的酸度，以保證ɑ-茄堿的穩(wěn)定存在，因此初步選擇ɑ-茄堿分析液的pH為4。

圖4 鐵氰化鉀對(duì)相對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響Fig.4 Effect of K3Fe（CN）6concentration on relative luminescence intensity

圖5 ɑ-茄堿溶液pH對(duì)相對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響Fig.5 Effect of pH value of ɑ-solanine concentration on relative luminescence intensity

2.2.4 緩沖液pH的選擇 緩沖液pH對(duì)體系發(fā)光強(qiáng)度影響見(jiàn)圖6。當(dāng)魯米諾pH為12.8時(shí)，體系化學(xué)發(fā)光信號(hào)最強(qiáng)，因此，初選魯米諾緩沖液pH為12.8。

圖6 魯米諾溶液pH對(duì)相對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響Fig.6 Effcet of pH of luminal solution onrelative luminescence intensity

2.3 多因素組合對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響

根據(jù)以上單因素實(shí)驗(yàn)得出的最佳反應(yīng)條件，設(shè)計(jì)了一個(gè)四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)（表2）以確定發(fā)光體系的最佳反應(yīng)條件。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，各因素影響化學(xué)發(fā)光程度大小順序?yàn)锳＞D＞B＞C，推出體系最佳優(yōu)化組合為A3B2C1D2，即魯米諾分析液濃度為4.0×10-4mol/L，鐵氰化鉀濃度為4.0×10-4mol/L，ɑ-茄堿分析液pH為3，緩沖液pH為12.8，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得其相對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度為14437.5。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、精密度及檢出限

在上述選定的最佳實(shí)驗(yàn)條件下，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度在8.0×10-4～9.0×10-3mg/mL，1.0×10-2～1.0×10-1mg/mL內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。其回歸方程如表4。對(duì)2×10-3mg/mL的ɑ-solanine進(jìn)行11次平行測(cè)定，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.1%。根據(jù)IUPAC建議，計(jì)算出檢出限為6.09×10-5mg/mL。

表2 正交實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2 Orthogonal array design matrix and test results

表3 正交實(shí)驗(yàn)方差分析Table 3 Variance analysis of the orthogonal test results

表4 校準(zhǔn)曲線的線性范圍及回歸方程Table 4 Linear range and regression equation of the calibration curves

2.5 干擾實(shí)驗(yàn)

在最佳優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，研究了可能的共存物質(zhì)對(duì)ɑ-茄堿測(cè)定的影響，當(dāng)ɑ-茄堿溶液濃度為2×10-3mg/mL時(shí)，干擾允許誤差為±5.0%時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，1000倍的K+、Na+、NO3-、Fe3+、Cl-，200倍的Mg2+、Ca2+、Al3+等常見(jiàn)離子無(wú)干擾，1倍的AS3+、Pb2+、Mn2+、Zn2+、Cd2+、Cu2+、Cr3+、Hg+等會(huì)催化魯米諾-鐵氰化鉀化學(xué)發(fā)光體系，對(duì)測(cè)定產(chǎn)生干擾，方法選擇性不好。為了避免金屬離子的干擾，可以加入0.5%（v/v）的5.0×10-4mol/L乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）作為掩蔽劑消除金屬離子的干擾。

2.6 樣品分析及回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表5 樣品中茄堿含量測(cè)定結(jié)果Table 5 Results of ɑ-solanine content in water

在最佳優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，以實(shí)驗(yàn)室自來(lái)水、宿舍自來(lái)水作為水樣測(cè)定ɑ-茄堿含量。然后采取標(biāo)樣加入法加入2×10-3mg/mL ɑ-茄堿對(duì)其進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表5所示。

3 結(jié)論

ɑ-茄堿對(duì)魯米諾-鐵氰化鉀化學(xué)發(fā)光體系發(fā)光強(qiáng)度有明顯的抑制作用。據(jù)此建立了在最佳條件下測(cè)定ɑ-茄堿的分析方法，實(shí)現(xiàn)了流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法測(cè)定飲用水中ɑ-茄堿的變化情況，該方法的檢出限達(dá)6.09×10-5mg/mL，線性范圍是8.0×10-4～1.0×10-1mg/mL。與常規(guī)方法相比，該方法具有儀器簡(jiǎn)單、快速、自動(dòng)化程度高以及即時(shí)預(yù)警等特點(diǎn)，可應(yīng)用于飲用水中ɑ-茄堿快速突變的檢測(cè)。

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Determination of ɑ-solanine in drinking water by flow-injection chemiluminescence system of luminol and potassium ferricyanide

ZHU Ding-bo，MA Qiang，YAN Ting，TENG Jiu-wei，TANG Shu-ze*
（Food Science and Technology Department，Jinan University，Guangzhou 510632，China）

In order to establish a new method for rapid determination of ɑ -solanine， a flow-injection chemiluminescence（FI-CL） system of luminol and potassium ferricyanide was developed.Results indicated that the CL reaction betweeen luminol and potassium ferricyanide was significantly reduced by ɑ-solanine.An excellent linear range for ɑ-solanine determination was 8.0×10-4～1.0×10-1mg/mL under the optimal condition.The limit detection of ɑ-solanine was 6.09×10-5mg/mL and relative standard deviation for the determination was 2.1%（n=11）.This method showed the advantages of simple operation，high degree of automation，easy to run on-line and real-time warning detection，and could be used as a rapid method for determination of ɑ-solanine in drinking water.

luminol；potassium ferricyanide；chemiluminescence；ɑ-solanine

TS201.6

A

1002-0306（2012）22-0084-04

2012－05－28 * 通訊聯(lián)系人

朱定波（1986-），男，碩士在讀研究生，研究方向：食品安全預(yù)警。

廣東省食品安全衛(wèi)生應(yīng)急技術(shù)中心（粵科函社字[2011]733號(hào)）。