超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定食品中葉酸含量

劉進(jìn)璽，鐘紅艦*，董小海

(農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(鄭州)，河南 鄭州 450002)

超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定食品中葉酸含量

劉進(jìn)璽，鐘紅艦*，董小海

(農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(鄭州)，河南 鄭州 450002)

建立食品中葉酸含量的超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定方法。樣品提取后以Acquity UPLC BEH C18柱(2.1mm×50mm，1.7μm)為色譜柱分離，以電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜在正離子選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下進(jìn)行測(cè)定。以乙腈-0.1%甲酸溶液(5:95，V/V)為流動(dòng)相、流速0.25mL/min、色譜柱溫度40℃、進(jìn)樣量2μL，母離子m/z 442.3、定量子離子m/z 295.1、定性子離子m/z 176.0，碰撞能量為14eV。對(duì)空白試樣進(jìn)行3個(gè)添加水平4個(gè)重復(fù)的添加結(jié)果表明：回收率80.7%～89.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差2.90%～3.85%。該方法檢出限1ng/mL，線(xiàn)性范圍0.001～1.000μg/mL。該方法具有樣品預(yù)處理簡(jiǎn)單、檢測(cè)周期短、靈敏度較高等優(yōu)點(diǎn)。

葉酸；食品；測(cè)定；超高效液相色譜-質(zhì)譜

葉酸(folic acid)又稱(chēng)VM、VB9，是一種重要的B族維生素，具有促進(jìn)泌乳、健美皮膚、防止白發(fā)、增進(jìn)食欲和防治口腔潰瘍的功效，是維持生物體正常生命過(guò)程所必須的一類(lèi)有機(jī)物質(zhì)。葉酸天然存在于部分食物當(dāng)中，也作為添加劑被適量加入到一些營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化食品、保健食品中，準(zhǔn)確測(cè)定葉酸含量對(duì)產(chǎn)品的生產(chǎn)加工、功效評(píng)價(jià)等有重要意義[1]。目前對(duì)葉酸的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)僅有復(fù)合預(yù)混合飼料中的高效液相色譜法[2]和嬰幼兒食品和乳品中的微生物法[3]，一般食品中葉酸的檢測(cè)方法還未見(jiàn)。雖然有一些食品中葉酸含量檢測(cè)方法的報(bào)道[4-15]，包括微生物分析法、高效液相色譜法、比色法、薄層層析法、熒光光度法等，但在實(shí)際工作中，以上幾種檢測(cè)方法均有比較明顯的缺點(diǎn)。微生物法用于檢測(cè)葉酸靈敏度高，但也存在許多局限性，如實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、重復(fù)性差、檢測(cè)結(jié)果不能區(qū)分各葉酸鹽形式等；對(duì)于高壓液相色譜法，由于一般食品中葉酸含量較低，紫外檢測(cè)器幾乎檢測(cè)不出來(lái)，與雜質(zhì)峰也很難分開(kāi)，只能檢測(cè)食品添加劑、藥等一些雜質(zhì)成分較少、葉酸含量較高的物質(zhì)[16]；比色法、薄層層析法和熒光光度法較費(fèi)時(shí)費(fèi)力。因此研發(fā)一種快速、靈敏、適合于食品中葉酸的檢測(cè)方法成為當(dāng)務(wù)之急，這也是食品企業(yè)和科研機(jī)構(gòu)近年來(lái)的一個(gè)研究熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)利用超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定葉酸的含量，結(jié)合超高效液相色譜和質(zhì)譜的優(yōu)點(diǎn)，分析速度快，靈敏度高，適用范圍寬。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

葉酸標(biāo)準(zhǔn)品 中國(guó)藥品生物制品檢定所；乙腈、甲酸(均為色譜純)；乙酸、抗壞血酸、碳酸鈉、氨水(均為分析純)；水(超純水)。

KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；Acquity超高效液相色譜儀 美國(guó)Waters公司；TSQ-Quantum質(zhì)譜儀 美國(guó)Thermo公司。

1.2 儀器條件

1.2.1 液相色譜條件

色譜柱：BEH C18柱(2.1mm×50mm，1.7μm)；色譜柱溫度：40℃；流動(dòng)相：乙腈-0.1%甲酸溶液(5:95，V/V)；流速：0.25mL/min；進(jìn)樣量：2μL。

1.2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧正離子電離(ESI+)；錐孔電壓：4000V；分辨率：0.7；母離子m/z 442.3；定量子離子m/z 295.1；定性子離子m/z 176.0；碰撞能量14eV。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

精確稱(chēng)取葉酸標(biāo)準(zhǔn)品0.01g(精確至0.0001g)，用Na2CO3溶液(0.1mol/L)溶解，用1mol/L鹽酸溶液調(diào)至pH7.0，用水定容至100mL，制得100μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。臨用前根據(jù)需要用流動(dòng)相稀釋成不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4 樣品前處理

1.4.1 稱(chēng)量

準(zhǔn)確稱(chēng)取5～10g樣品于100mL容量瓶中，加入0.5g抗壞血酸，70mL氨水溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%)溶解，40℃水浴超聲10min。

1.4.2 脫脂和去蛋白

加入2mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的乙酸溶液，再用氨水溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%)定容。無(wú)脂和蛋白樣品可不做此步驟。

1.4.3 離心與過(guò)濾

對(duì)于較混濁樣品，需高速離心，取上清液過(guò)0.45μm濾膜，待上機(jī)。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理?xiàng)l件的確定

葉酸在堿性條件下特別穩(wěn)定，見(jiàn)光和受熱不會(huì)分解[17]，而其他水溶性維生素則在酸性條件下穩(wěn)定，故溶解樣品時(shí)用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%氨水溶液，可以避免其它水溶性維生素的干擾。在實(shí)驗(yàn)中分別對(duì)常溫、30、40℃提取效果比較，結(jié)果表明40℃，提取10min的條件可以得到滿(mǎn)意的效果。經(jīng)過(guò)對(duì)乙腈、甲醇、高氯酸、硫酸銅、乙酸等溶劑進(jìn)行篩選[18]，發(fā)現(xiàn)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%高氯酸和0.1%乙酸對(duì)樣品的去脂去蛋白效果較好，且按1.4節(jié)步驟處理葉酸標(biāo)準(zhǔn)品后，其回收率均可達(dá)80%以上。但考慮到實(shí)驗(yàn)的方便及對(duì)柱子的影響，最終確定樣品前處理溶劑為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%乙酸。

2.2 流動(dòng)相組成優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

采用不同比例的乙腈-0.1%甲酸溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，當(dāng)乙腈-0.1%甲酸溶液的體積比為5:95時(shí)，葉酸與雜質(zhì)分離效果好，分析時(shí)間適當(dāng)，所以選用乙腈-0.1%甲酸溶液(5:95，V/V)作為流動(dòng)相。

2.3 質(zhì)譜條件優(yōu)化

配制質(zhì)量濃度0.5μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在全掃描方式下通過(guò)六通閥進(jìn)樣，調(diào)節(jié)電離源各個(gè)參數(shù)得到較強(qiáng)的[M+H]峰。在該條件下，對(duì)選定的母離子進(jìn)行子離子掃描，優(yōu)化碰撞能量等參數(shù)，將兩個(gè)響應(yīng)較強(qiáng)的子離子作為檢測(cè)的碎片離子，選擇其中多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring，MRM)色譜圖峰形好、響應(yīng)值高的1個(gè)離子用于定量計(jì)算，確定定量離子m/z 295.1，定性離子m/z 176.0。葉酸的離子流色譜圖和離子掃描質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1、2。

圖1 葉酸空白加標(biāo)0.1μg/mL的總離子流圖Fig.1 Chromatogram of blank samples spiked with 0.1 μg/mL folic acid

圖2 葉酸離子掃描質(zhì)譜圖Fig.2 Mass spectrum of folic acid

2.4 方法線(xiàn)性范圍與檢出限

準(zhǔn)確移取葉酸儲(chǔ)備液，用流動(dòng)相依次稀釋?zhuān)渲瞥?.001、0.005、0.010、0.100、0.500、1.000μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以葉酸的質(zhì)量濃度和峰面積為縱、橫坐標(biāo)，繪制線(xiàn)性關(guān)系曲線(xiàn)。結(jié)果可得線(xiàn)性回歸方程為Y＝4.301×10-8A－0.0244，相關(guān)系數(shù)r＝0.9996，表明葉酸在0.001～1.000μg/mL范圍內(nèi)，葉酸的質(zhì)量濃度和峰面積線(xiàn)性關(guān)系良好，適合做定量分析。

對(duì)空白樣品進(jìn)行不同水平的加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，按1.4節(jié)對(duì)樣品進(jìn)行前處理后，檢測(cè)結(jié)果表明當(dāng)RSN＞3時(shí)檢出限為1ng/mL。

2.5 回收率與精密度

向不含葉酸的空白試樣中添加10、50、200μg/100g三個(gè)水平的葉酸標(biāo)樣溶液，分別進(jìn)行4次平行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。由此可見(jiàn)，葉酸回收率在80.7%～89.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.90%～3.85%，說(shuō)明本方法比較準(zhǔn)確。

表1 葉酸的回收率與精密度Table 1 Recovery rates and determination precision (RSD) of folic acid

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Determination of Folic Acid in Food by UPLC-MS/MS

LIU Jin-xi，ZHONG Hong-jian*，DONG Xiao-hai
(Center of Inspection and Testing for Agricultural Products(Zhengzhou), Ministry of Agriculture, Zhengzhou 450002, China)

A method for the determination of folic acid in food by ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry (UPLC-MS/MS) has been established. Sample extract was separated on Acquity UPLC BEH C18 column(2.1 mm × 50 mm, 1.7 μm) using a mobile phase consisting of acetonitrile and 0.1% formic acid (5:95, V/V) at a flow rate of 0.25 mL/min, and analyzed by electrospray ionization-tandem mass spectrometry (ESI-MS/MS) in a positive-ion selective reaction monitoring (SRM) mode at a collision energy of 14 eV using m/z 442.3, m/z 295.1 and m/z 176.0 as the parent, quantitative and qualitative ions, respectively. The column temperature and the injection volume were set as 40 ℃ and 2 μL, respectively.The average blank spike recoveries for 4 replicate determinations across three spike levels were in the range of 80.7%－89.7%with RSD of 2.90%－3.85%. The limit of detection was 1 ng/mL. An excellent linear relationship was achieved in the range of 0.001－1.000 μg/mL. The method was characterized by simple operation, time saving and high sensitivity.

folic acid；food；determination； ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry (UPLC-MS/MS)

TS207.3；O657

A

1002-6630(2012)08-0233-03

2011-04-20

劉進(jìn)璽(1981—)，女，助理研究員，碩士，研究方向?yàn)榉治龇椒ㄅc檢測(cè)技術(shù)。E-mail：liujinxi1020@163.com

*通信作者：鐘紅艦(1971—)，男，副研究員，碩士，研究方向?yàn)檗r(nóng)(獸)藥殘留分析和相關(guān)代謝。E-mail：80456811@163.com