永川豆豉傳統(tǒng)發(fā)酵過程中的大豆異黃酮變化

索化夷，騫 宇，盧 露，闞建全,*

(1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶 400715；3.重慶教育學(xué)院生物與化學(xué)工程系，重慶 400067)

永川豆豉傳統(tǒng)發(fā)酵過程中的大豆異黃酮變化

索化夷1,2，騫 宇1,3，盧 露1,2，闞建全1,2,*

(1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶 400715；3.重慶教育學(xué)院生物與化學(xué)工程系，重慶 400067)

為了探明永川豆豉在傳統(tǒng)發(fā)酵過程中大豆異黃酮總含量和構(gòu)成變化，采用高效液相色譜技術(shù)對永川豆豉傳統(tǒng)發(fā)酵過程中大豆異黃酮總量和構(gòu)成進(jìn)行測定。結(jié)果表明：永川豆豉在發(fā)酵加工過程中大豆異黃酮總含量由發(fā)酵起始的3117mg/kg下降到豆豉成熟時的1754mg/kg；大豆異黃酮構(gòu)成變化顯著，游離苷元型大豆異黃酮含量迅速增加由發(fā)酵起始的3.2%上升到豆豉成熟時的95.7%，同時結(jié)合糖苷型大豆異黃酮含量迅速降低。

永川豆豉；大豆異黃酮；苷元型異黃酮；糖苷型異黃酮

植物雌激素(phytoestrogens)為雜環(huán)多酚類化合物，是一種具有弱雌激素作用的植物成分，主要包括異黃酮(isoflavone)、木脂素(lignan)和香豆雌酚(coumestrol)3大類，其中大豆異黃酮(soybean isoflavone)是非常重要一類食物源植物雌激素。大豆異黃酮是大豆生長中形成的一類次生代謝產(chǎn)物，包含染料木苷(genistin)、染料木黃(genistein)、黃豆苷(daidzin)和黃豆苷元(daidzein)等12種成分[1-2]。大豆異黃酮除了可以有效地防治癌癥、心血管疾病、抵抗骨質(zhì)疏松癥、婦女更年期綜合癥、糖尿病等疾病，還具有抗早老年性癡呆、抗機(jī)體免疫力下降、抗菌消炎、抗機(jī)體功能衰老、抗溶血等作用，因而越來越受到人們的重視。

大豆異黃酮分為結(jié)合型糖苷(glucosides)(大豆苷、大豆黃苷及染料木苷等)和游離型苷元(aglycons)(大豆素、大豆黃素及染料木素)兩類。天然存在大豆異黃酮有97%～98%是以β-葡萄糖苷形式存在，只有2%～3%是以游離型苷元形式存在。結(jié)合型的異黃酮在腸道內(nèi)不能直接吸收，不具有生物活性，所以異黃酮的主要活性物質(zhì)是染料木素和大豆素[3-6]。

因此，將大豆異黃酮糖苷轉(zhuǎn)化為異黃酮苷元具有十分重要的意義[7-10]。目前學(xué)者主要對大豆異黃酮的生物活性及提取工藝進(jìn)行研究[11-13]，而在大豆異黃酮中結(jié)合型糖苷與游離型苷元兩種類型的轉(zhuǎn)化規(guī)律研究卻很少[14-16]。本實(shí)驗(yàn)通過對毛霉型豆豉——永川豆豉在傳統(tǒng)發(fā)酵過程中大豆異黃酮總量和構(gòu)成變化情況進(jìn)行研究，總結(jié)大豆異黃酮總含量與構(gòu)成變化規(guī)律，為永川豆豉產(chǎn)品開發(fā)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

永川傳統(tǒng)毛霉型豆豉采自重慶市永川豆豉食品有限公司，其制作工藝流程為：大豆篩選→浸泡→瀝干→蒸煮→冷卻→自然發(fā)酵制曲→添加輔料→發(fā)酵后熟→成品。S1～S16分別代表豆豉樣品的不同加工階段(表1)。

表1 實(shí)驗(yàn)樣品代號及其代號含義Table 1 Sampling time points and codes during Douchi fermentation

大豆苷(daidzin)、黃豆黃苷(glycitin)、染料木苷(genistin)、大豆苷元 (daidzein)、黃豆黃素(glycitein)、染料木素(genistein)標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98.0%) 成都曼斯特有限公司；乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純) 成都市科龍化工試劑廠；磷酸(色譜純) 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-10A高效液相色譜儀(含紫外檢測器) 日本島津公司；Milli-Q超純水器 美國Millipore公司；ALPAAI-4LSC真空冷凍干燥機(jī) 美國Christ公司；超聲波清洗器昆山超聲波儀器公司。

1.3 樣品前處理

參考毛峻琴等[16]、黃蕓等[17]的方法樣品經(jīng)真空冷凍干燥后，用粉碎機(jī)將豆豉樣品磨粉(過80目篩)，稱取樣品0.5～1g(精確至0.1mg)，用30mL體積分?jǐn)?shù)80%的甲醇溶液溶解，溫度40℃、頻率40kHz及功率100W超聲抽提20min，以8000r/min離心15min，收集上清液。再重復(fù)以上操作抽提，總共抽提3次。收集總的上清液并用體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇溶液定容到100mL，用0.45μm有機(jī)濾膜過濾，濾液進(jìn)行高效液相色譜(high performance liquid chromatography，GC-MS)測定。

1.4 色譜條件[18]

色譜柱：Aglient C18(4.6mm×150mm，5μm)；流動相為乙腈(A)-磷酸溶液(pH3.0)；柱溫30℃；流速0.8mL/min；進(jìn)樣量10μL；檢測波長260nm；梯度洗脫程序見表2。

表2 色譜實(shí)驗(yàn)梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution program

1.5 大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的建立

稱取大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素各4mg，分別置于10mL容量瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)80%的甲醇溶液至接近刻度，超聲處理30min，再用體積分?jǐn)?shù)80%的甲醇溶液定容，即為400mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。將以上配制的異黃酮標(biāo)準(zhǔn)溶液用溶液80%的甲醇溶液稀釋成質(zhì)量濃度分別為20、40、60、80、100、120mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。依次進(jìn)樣，以峰面積為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制工作曲線，其線性關(guān)系及檢出限。

1.6 大豆異黃酮各組分含量的計算

樣品中大豆異黃酮各組分的含量分別按式(1)計算：

式中：Xi為樣品中大豆異黃酮單一組分的含量/(mg/kg)分別從大豆苷(X1)、黃豆黃苷(X2)、染料木苷(X3)、大豆苷元(X4)、黃豆黃素(X5)、染料木素(X6)；Ci為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的大豆異黃酮單一組分的質(zhì)量濃度/(mg/L)；V為樣品稀釋液總體積/mL；m為固體樣品質(zhì)量/g。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖

圖1 大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatogram of mixed soybean isoflavone standards

將大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品溶液稀釋10倍，經(jīng)過HPLC配合紫外檢測器測定，依據(jù)單一標(biāo)準(zhǔn)樣品的保留時間對樣品溶液中的組分進(jìn)行定性，可得大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖(圖1)，其中異黃酮中的大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素6種成分的出峰時間分別為15.029、16.062、20.469、26.997、28.504、38.479min。

2.2 大豆異黃酮各組分的線性關(guān)系和檢出限

經(jīng)HPLC配合紫外檢測器測定，以峰面積為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制工作曲線，其線性關(guān)系及檢出限結(jié)果見表3。

表3 回歸方程和檢出限Table 3 Regression equations and detection limits of 6 soybean isoflavones

2.3 樣品中的大豆異黃酮總含量

圖2 不同時期毛霉型豆豉中大豆異黃酮總含量變化Fig.2 Change in total soybean isoflavone content during Douchi fermentation

如圖2所示，干黃豆樣品與浸泡樣品的異黃酮含量比經(jīng)蒸煮后的異黃酮總含量迅速增加，但Coward等[19]研究表明，121℃加熱15min可使異黃酮損失約20%，加熱可使丙二?；慄S酮通過脫羧作用轉(zhuǎn)化為乙?；慄S酮，或脫酯轉(zhuǎn)化為β-葡萄糖苷型異黃酮。這是由于大豆原料結(jié)構(gòu)致密，浸泡后雖然膨脹但大豆異黃酮浸出提取效率不高，但經(jīng)過蒸煮處理后大豆結(jié)構(gòu)變得松散，且蒸煮溫度未達(dá)121℃，且短暫制曲更有利于大豆組織結(jié)果破壞，使異黃酮提取率提高，而并沒有明顯改變其含量。隨后的制曲得進(jìn)一步進(jìn)行及后發(fā)酵過程中，異黃酮總含量有下降的趨勢，其中制曲階段損失了33%，后酵階段損失了14%，這與Wang等[4]研究米曲霉型豆豉的變化趨勢相同。

2.4 大豆異黃酮各組分含量測定

表4 大豆異黃酮各組分含量Table 4 Change in soybean isoflavone composition during Douchi fermentation

樣品在制曲及后發(fā)酵的各個階段，大豆異黃酮各組分含量都在不斷變化，大豆苷、黃豆黃苷分別由制曲初期的原來的957.59、217.16mg/kg減少到幾乎為0；染料木素也由原來的565.62mg/kg減少到75.24mg/kg；而大豆苷元、黃豆黃素分別由1.3、51.82mg/kg增加到649.70、150.03mg/kg；染料木素也由最初的未檢出增加到880.01mg/kg。所以可以看出變化的總體趨勢為異黃酮大部分由糖苷型轉(zhuǎn)化為苷元型，這與其他相關(guān)報道[4,10,14]的結(jié)果是一致的。在原料大豆和制曲初始階段糖苷型異黃酮中，以染料木苷和大豆苷為主。而成熟豆豉中苷元型異黃酮中，以染料木素和大豆苷元為主。很多研究表明，主要起生物活性作用的成分也正是染料木素和大豆苷元。

2.5 豆豉中糖苷型和苷元型異黃酮的轉(zhuǎn)化

大豆異黃酮分為結(jié)合型糖苷和游離型苷元兩類，因?yàn)榻Y(jié)合型的異黃酮在腸道內(nèi)不能被人體直接消化吸收，不具生物活性，所以異黃酮的主要活性物質(zhì)是游離型苷元。大豆異黃酮中糖苷型和苷元型異黃酮含量的構(gòu)成也是一個很重要的衡量指標(biāo)。不同時期毛霉型豆豉中糖苷型和苷元型異黃酮含量見圖3?？梢钥闯?，大豆在發(fā)酵前和發(fā)酵后糖苷型和苷元型異黃酮含量比值相差較大，在制曲過程中，苷元型異黃酮含量占總異黃酮含量的比值從6.1%增加到54.9%；后發(fā)酵過程中，苷元型異黃酮含量占總異黃酮含量的比值從81.5%上升到95.7%，所以發(fā)酵前和發(fā)酵后苷元型異黃酮含量總共增加了89.6%，這與前人的報道[4,10,14]一致，且daidzein和genistein兩種生理活性高的苷元型異黃酮在豆豉中含量豐富。這是因?yàn)樘擒招彤慄S酮是由游離型異黃酮與一分子的葡萄糖以7-位氧苷鍵結(jié)合的產(chǎn)物，發(fā)酵過程中微生物產(chǎn)生β-葡萄糖苷酶作用于糖苷型異黃酮分子中的氧苷鍵，同時豆豉總酸逐漸提高使其葡萄糖基團(tuán)脫掉。與其他豆豉相比，永川傳統(tǒng)毛霉型豆豉的苷元型異黃酮含量很高，僅次于貴州淡豆豉的96%，應(yīng)得到進(jìn)一步開發(fā)利用。浸泡后的樣品2比樣品1苷元型異黃酮含量增加了8.7%，可見浸泡可使大豆中的葡萄糖苷型異黃酮轉(zhuǎn)化為苷元型異黃酮，這主要是由于大豆本身內(nèi)源性的β-葡萄糖苷酶水解異黃酮葡萄糖苷作用的結(jié)果，這與劉亞瓊等[14]的研究結(jié)果相同。從樣品5開始，豆豉的苷元型異黃酮含量急劇上升，比樣品4增加了將近1倍，這與豆豉制曲2d后，微生物在豆豉上迅速繁殖使得β-葡萄糖苷酶的活性增強(qiáng)有關(guān)。

圖3 不同時期毛霉型豆豉中糖苷型和苷元型大豆異黃酮總含量Fig.3 Changes in total contents of glucosides and aglycone in during Douchi fermentation

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過對不同時期傳統(tǒng)毛霉型豆豉異黃酮含量的測定和成分變化比較分析發(fā)現(xiàn)：永川豆豉在傳統(tǒng)發(fā)酵過程中大豆異黃酮總量會發(fā)生較大流失，下降到制曲初期的57%；在傳統(tǒng)發(fā)酵過程中永川豆豉大豆異黃酮構(gòu)成發(fā)生根本轉(zhuǎn)變由糖苷型轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂猩锘钚缘能赵停伎偭康?5.7%。使豆豉具有更高的保健功效；在原料大豆和制曲初始階段苷型異黃酮中，以染料木苷和大豆苷為主。而成熟豆豉中苷元型異黃酮中，以染料木素和大豆苷元為主。

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Change in Soybean Isoflavone of Yongchuan Douchi at Different Stages during Traditional Fermentation

SUO Hua-yi1,2，QIAN Yu1,3，LU Lu1,2，KAN Jian-quan1,2,*

(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China；
2. Engineering Technology Research Center for Characteristic Food of Chongqing, Chongqing 400715, China；
3. Department of Biological and Chemical Engineering, Chongqing Education College, Chongqing 400067, China)

Soybean isoflavones are a group of important functional components in Douchi such as genistein and daidzein. The content of soybean isoflavone in Yongchuan Douchi during the traditional fermentation process was determined by high performance liquid chromatography (HPLC) in this study. The results showed that the content of soybean isoflavone revealed a gradual decrease from 3117 to 1754 mg/kg during the fermentation process. The content of aglycone exhibited a dramatic increase from 3.2% to 95.7% while the content of glucosides presented a considerable drop.

Yongchuan Douchi；soybean isoflavone；aglycone；glucosides

TS264.2

A

1002-6630(2012)08-0270-04

2011-06-30

西南大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(XDJK2009C041)

索化夷(1978—)，男，講師，博士研究生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：birget@swu.edu.cn

*通信作者：闞健全(1965—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：ganjq1965@163.com