林春榕，潘 云，吳學(xué)東，曲文超，路會俠，莊立峰，劉慶文，盛 盼

（1.大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000；2.大理學(xué)院附屬醫(yī)院，云南大理 671000）

幼鼠小腸缺血-再灌注腸組織的形態(tài)學(xué)觀察

林春榕1，潘 云2，吳學(xué)東2，曲文超2，路會俠2，莊立峰2，劉慶文2，盛 盼2

（1.大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000；2.大理學(xué)院附屬醫(yī)院，云南大理 671000）

目的：觀察幼鼠小腸缺血-再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）腸組織形態(tài)學(xué)變化。方法：將32只4周齡（Sprague Dawley，SD）大鼠隨機(jī)分成2組即假手術(shù)組（Sham組）和缺血-再灌注組（I/R組），每組各16只。Sham組僅暴露腹腔臟器，不作任何干預(yù)；I/R組經(jīng)阻斷腸系膜上動脈60 min后恢復(fù)血供，于再灌注30、60、90、120 min每組動物各處死4只取小腸組織進(jìn)行組織學(xué)Chiu’s評分，結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析和組間t檢驗。結(jié)果：Sham組腸組織形態(tài)正常；I/R組小腸組織發(fā)生了明顯的缺血和炎癥反應(yīng)并隨再灌注時間延長而加重，各觀察時間點(diǎn)組織學(xué)評分在組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，各值在I/R組高于Sham組（P＜0.05）。結(jié)論：幼鼠腸I/R導(dǎo)致腸組織病理損傷并隨再灌注時間延長而加重。

腸缺血-再灌注損傷；腸組織；組織學(xué)；幼鼠

腸缺血-再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）是小兒常見的問題〔1-3〕，盡管由于各種原因?qū)е履cI/R所導(dǎo)致的腸道損傷已被廣泛重視，但通常情況下難以獲得腸I/R后的組織標(biāo)本進(jìn)行研究，因而對小兒腸I/ R腸組織損傷的變化規(guī)律和轉(zhuǎn)歸認(rèn)識尚少，本研究利用幼鼠造成腸I/R模型并動態(tài)觀察腸管I/R的后腸組織的形態(tài)學(xué)變化，以此闡述腸I/R對腸組織形態(tài)的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 4周齡健康（Sprague Dawley，SD）大鼠幼鼠共32只，雌雄不限，SPF級，動物編號：許可證SCXK（渝）2007-017，體重100±15 g。手術(shù)室溫度25～27℃，相對濕度50%～65%。

1.1.2 實驗試劑、器械、儀器 10%水合氯醛溶液（大理學(xué)院附屬醫(yī)院制劑室配制）；0.9%生理鹽水；常用消毒劑；小手術(shù)器械及手術(shù)用品。

BM-Ⅷ生物組織包埋及冷凍機(jī)（孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司），PHY-Ⅲ病理組織漂烘儀（常州市中威電子儀器有限公司），萊卡石蠟切片機(jī)（LE-ICARM2025型），OLYMPUSBX-41型多功能生物顯微鏡（日本奧林巴斯光學(xué)有限公司）和HMIAS-2000型高清晰醫(yī)學(xué)彩色圖象分析儀（武漢千屏影像公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 32只DS大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組）和I/R組，每組16只。

1.2.2 動物實驗 用10%水合氯醛溶液腹腔內(nèi)注射（3 mL/kg）麻醉后仰臥位固定，腹部去毛，消毒后取上腹正中縱行切口，依次切開入腹，尋找并游離腸系膜上動脈（superior mesenteric artery，SMA）根部，見圖1。用橡皮條阻斷腸系膜上動脈血流60 min，見圖2。松開橡皮條，恢復(fù)腸系膜血流，造成小腸缺血-再灌注模型。Sham組動物在開腹后不做任何干預(yù)于I/R組再灌注后30、60、90、120 min時4個時間點(diǎn)每組各處死動物4只，取距回盲瓣5 cm處近端2 cm長的小腸標(biāo)本備做組織學(xué)研究。

圖1 尋及腸系膜上動脈

圖2 阻斷腸系膜上動脈血供

1.2.3 組織學(xué)觀察 所取小腸組織制成6～8 μm厚度的切片后進(jìn)行H-E染色，光鏡下觀察腸粘膜的形態(tài)學(xué)變化，每張切片隨機(jī)選擇鏡下10視野（100×），腸粘膜損傷程度按Chiu氏6級評分法〔4-5〕進(jìn)行組織病理評分：0級為正常腸粘膜絨毛結(jié)構(gòu)，組織形態(tài)正常，記為0分；1級為腸粘膜絨毛頂端上皮下間隙增寬，腸壁組織水腫，記為1分；2級為絨毛上皮下間隙明顯增寬，絨毛上皮與固有膜剝脫，記為2分；3級為絨毛上皮成塊脫落，記為3分；4級為絨毛上皮完全脫落，固有膜結(jié)構(gòu)裸露，記為4分；5級為固有膜結(jié)構(gòu)崩解形成潰瘍并出血，記為5分。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 用SPSS11.0整理數(shù)據(jù)。各組資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間進(jìn)行單因素方差分析和組間t檢驗，組內(nèi)比較采用配對t檢驗，P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

本實驗共用動物32只，I/R組經(jīng)夾閉腸系膜上動脈后相應(yīng)腸系膜血管搏動消失，腸管顏色蒼白并逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榘底仙?，見圖3。缺血60 min后恢復(fù)血供，在再灌注后30 min腸管顏色逐漸恢復(fù)的同時逐漸出現(xiàn)腸壁充血水腫并不斷加重，至再灌注90 min時腸管呈現(xiàn)暗紫色形如缺血60 min時的改變，見圖4。繼之腸管顏色逐漸好轉(zhuǎn)，直至120 min時腸管色澤恢復(fù)但水腫仍然較為明顯。

圖3 小腸缺血再灌注模型

圖4 小腸缺血后再灌注90 min的腸管改變

2.1 組織學(xué)觀察結(jié)果 Sham組腸組織無水腫及出血，腸管各層及腸組織內(nèi)各結(jié)構(gòu)正常。見圖5。

I/R組在再灌注30 min的腸組織可見充血水腫，而在60 min及以后2個時間點(diǎn)出現(xiàn)小腸絨毛脫落和缺損、點(diǎn)狀出血和潰瘍形成、粘膜不同程度的絨毛排列紊亂和組織內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤，其中再灌注以90 min時最為明顯，呈現(xiàn)明顯的粘膜上皮脫落，潰瘍形成并出血，腸組織內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤和組織結(jié)構(gòu)松散。見圖6。120 min時腸組織形態(tài)無明顯改善，但潰瘍和出血情況也無明顯加重。

圖5 正常腸粘膜（HE×100）Chiu氏評分0分

圖6 缺血再灌注組腸粘膜（HE×100）Chiu氏評分5分

2.2 腸粘膜損傷程度的Chiu氏6級評分 通過對小腸組織進(jìn)行病理損傷的Chiu氏6級評分，獲得各組各時間點(diǎn)的平均分值。見表1。Sham組各時間點(diǎn)的評分值變化較小，而各時間點(diǎn)I/R組的評分值均較Sham組增高，并呈現(xiàn)逐漸增高的趨勢，其中以再灌注90 min時為最高，120 min時有所回降。

表1 各組各時間點(diǎn)小腸粘膜損傷病理Chiu氏評分結(jié)果

Chiu’s評分值在組間比較經(jīng)單因素方差分析和組間各相應(yīng)時間點(diǎn)評分值比較經(jīng)t檢驗差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，I/R組的評分明顯高于Sham組（P＜0.05）；在組內(nèi)各時間點(diǎn)Chiu’s評分值比較，Sham組各時間點(diǎn)測得值間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而在I/R組內(nèi)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但僅在60、90和120 min時的評分高于30 min時的評分值，而評分值在60、90、120 min 3個時間點(diǎn)間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

腸I/R是常見的臨床問題，也是小兒外科常見的臨床現(xiàn)象。腸扭轉(zhuǎn)、嵌頓疝、腸套疊、粘連帶壓迫、腸內(nèi)糞石或蛔蟲團(tuán)塊等多種原因所致腸梗阻和小腸移植、失血性休克等均造成腸缺血，在腸梗阻整復(fù)和、休克復(fù)蘇后使腸管血供恢復(fù)即形成腸I/R。腸缺血將造成不同程度的組織損傷，而再灌注后腸組織在原缺血造成損傷的基礎(chǔ)上組織損傷將進(jìn)一步加重，則形成再灌注損傷。腸道的血供豐富因而對缺血缺氧十分敏感，是再灌注損傷時最易受累的器官之一，然而腸道又是大量細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物內(nèi)毒素的貯存場所，腸I/R不僅可導(dǎo)致腸道損傷還可導(dǎo)致遠(yuǎn)隔器官的損傷，甚至發(fā)生多系統(tǒng)和器官功能衰竭〔6-7〕。因此，進(jìn)行腸I/R腸組織形態(tài)學(xué)研究對進(jìn)一步研究和認(rèn)識小兒腸I/R損傷及其發(fā)生機(jī)制有重要的意義。

本實驗利用幼鼠制作腸I/R模型，在結(jié)扎腸系膜上動脈阻斷小腸血供1 h后恢復(fù)血流灌注，腸管色澤好轉(zhuǎn)，但再灌注90 min時腸管再度呈現(xiàn)缺血的改變；在再灌注的120 min觀察期內(nèi)，腸管水腫進(jìn)行性加重，而Sham組腸管外觀無明顯變化。組織學(xué)上呈現(xiàn)缺血和炎癥的改變并隨再灌注時間延長而加重，其中以再灌注90 min時改變最為明顯，對組織學(xué)損傷程度的Chiu氏評分結(jié)果與腸管大體和鏡下改變相吻合。實驗結(jié)果表明，幼鼠小腸缺血1 h恢復(fù)血供后，腸組織缺血的狀況并不隨著血供恢復(fù)而迅速改善，而是呈現(xiàn)缺血的后果—壞死逐漸變得明顯，隨著再灌注時間延長出現(xiàn)粘膜點(diǎn)狀出血和潰瘍形成；在再灌注過程中，腸組織發(fā)生了炎癥反應(yīng)，出現(xiàn)組織充血、水腫、滲出、壞死和炎性細(xì)胞浸潤的病理過程。如果說缺血的改變源于腸系膜血供的中斷，并在再灌注過程中逐漸表現(xiàn)出來，而組織壞死脫落需要時間，因而表現(xiàn)為再灌注過程中缺血的改變逐漸加重，那么炎癥反應(yīng)則是在缺血基礎(chǔ)上組織發(fā)動的另一病理過程，這一過程造成了新的更嚴(yán)重的變化，表現(xiàn)為腸管缺血—好轉(zhuǎn)—再缺血—最終好轉(zhuǎn)。出現(xiàn)再缺血的現(xiàn)象可能歸結(jié)于“無復(fù)流現(xiàn)象（no-reflow phenomenon）”〔7〕。

本實驗觀察再灌注時間雖較短，但卻發(fā)生了腸組織形態(tài)的轉(zhuǎn)折性變化，這可能與動物年齡和處理因素有關(guān)。由于幼年動物機(jī)體的防御機(jī)制發(fā)育并不完善，且組織中水的含量大于成年動物，加之幼年動物的修復(fù)能力較強(qiáng)，一旦有損傷因素存在組織將發(fā)生快速而明顯的反應(yīng)，而一旦損傷因素去除，修復(fù)也比較快。有對肝臟I/R損傷的研究表明，幼年動物的病理改變較成年動物的改變輕〔8〕。本實驗僅阻斷幼鼠小腸動脈血供，而在臨床各種原因?qū)е滦耗cI/R損傷往往都是先發(fā)生靜脈回流障礙，繼之動脈血供中斷，患兒腸管的病理變化應(yīng)該更為明顯而且病理過程更長。有學(xué)者通過動物實驗觀察到，在相同的觀察時間內(nèi)，不同的處理因素獲得的病理改變程度也不一致，其中阻斷動脈血供的病理改變較阻斷靜脈或動靜脈同時阻斷的變化要輕〔9〕。基于以上原因，在本實驗觀察到再灌注過程中幼鼠腸管出現(xiàn)一過性再缺血的現(xiàn)象。

研究表明，幼鼠腸I/R導(dǎo)致腸組織缺血性損傷的同時發(fā)生了炎癥反應(yīng)并隨再灌注時間延長而加重，但其機(jī)制尚未完全明了，有待進(jìn)一步研究。

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Histological Study of Intestine with Ischemia/Reperfusion Injury in Young Rats

LIN Chunrong1,PAN Yun2,WU Xuedong2,QU Wenchao2,LU Huixia2,ZHUANG Lifeng2,LIU Qingwen2，SHENG Pan2
（1.Pre-clinical College,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China；2.Affiliated Hospital of Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective:To explore the intestinal histological changes of intestinal ischemic/reperfusion（I/R）injury in young rats. Methods:32 Sprague Dawley（SD）rats at 4 weeks old were divided into 2 groups with 16 in each group randomly,and there were sham operated group as a control and I/R group.The abdominal cavity were exposed in all rats but not any intervene in sham group, the superior mesenteric artery were occluded in I/R group for 60 min and followed by 30 min,60 min,90 min and 120 min for reperfusion and 4 rats were harvested at each time point.The intestine specimens were obtained for pathological study and determination of histopathologic score.The data were analyzed statistically.Results:There were pathological changes of ischemia and inflammatory obviously and getting severer with the reperfusion time prolong in all rats but in the sham group.There was statistical significance as a result of the Chiu's score between two groups in every time point（P＜0.05）.The scores in I/R group were higher than that in sham group（P＜0.05）.The score was highest at 90min among four time points in each I/R group.Conclusion:The pathological changes of intestinal injury caused by I/R were getting severer with reperfusion prolong.

intestinal ischemia-reperfusion injury；intestine；histology；young rat

Q463［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A［文章編號］1672-2345（2012）03-0024-04

云南省自然科學(xué)基金資助項目（2009ZC121M）

2011-12-31

2012-03-06

林春榕，副教授，主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究.

（責(zé)任編輯 董 杰）