• 
    

    
    

      99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

      5-氮雜-2′-脫氧胞苷對(duì)胰腺癌細(xì)胞PANC1的組織因子途徑抑制物-2表達(dá)及CpG島甲基化的影響

      2012-11-06 07:59:53湯志剛鄭浩黃強(qiáng)陳炯
      中華胰腺病雜志 2012年2期
      關(guān)鍵詞:失活癌基因條帶

      湯志剛 鄭浩 黃強(qiáng) 陳炯

      ·論著·

      5-氮雜-2′-脫氧胞苷對(duì)胰腺癌細(xì)胞PANC1的組織因子途徑抑制物-2表達(dá)及CpG島甲基化的影響

      湯志剛 鄭浩 黃強(qiáng) 陳炯

      目的探討甲基化酶抑制劑5-氮雜-2′-脫氧胞苷(5-Aza-dC)對(duì)胰腺癌細(xì)胞系PANC1的抑癌基因組織因子途徑抑制物2(tissue factor pathway inhibitor 2,TFPI-2)甲基化水平及基因表達(dá)的影響。方法應(yīng)用1×10-7、5×10-7、1×10-6mol/L的5-Aza-dC處理胰腺癌細(xì)胞系PANC1。用甲基化特異性PCR(MSP)、RT-PCR及蛋白質(zhì)印跡法檢測細(xì)胞TFPI-2基因的甲基化狀態(tài)、mRNA及蛋白的表達(dá)。結(jié)果未經(jīng)5-Aza-dC處理的PANC1細(xì)胞的TFPI-2基因CpG島為完全甲基化,無TFPI-2 mRNA及蛋白的表達(dá)。1×10-7、5×10-7、1×10-6mol/L的5-Aza-dC處理后,PANC1細(xì)胞的TFPI-2基因CpG島甲基化逆轉(zhuǎn),從不完全甲基化到完全非甲基化; TFPI-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.211±0.087、0.327±0.068、0.609±0.017;TFPI-2蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.429±0.121、0.675±0.044、1.132±0.124,呈劑量依賴性增加(P<0.05)。結(jié)論胰腺癌細(xì)胞系PANC1的TFPI-2啟動(dòng)子高甲基化可能是導(dǎo)致該基因表達(dá)下調(diào)甚至失活的主要原因。5-Aza-dC能夠逆轉(zhuǎn)其高甲基化狀態(tài),并誘導(dǎo)TFPI-2 mRNA及蛋白重新表達(dá)。

      胰腺腫瘤; 甲基化; 組織因子途徑抑制物2; 5-氮雜-2′-脫氧胞苷

      胰腺癌的發(fā)生發(fā)展涉及到多個(gè)抑癌基因的異常改變,而抑癌基因的失活又涉及多種途徑。其中抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的高甲基化被認(rèn)為是導(dǎo)致抑癌基因表達(dá)沉默甚至失活的主要原因之一[1]。人類組織因子途徑抑制物-2(TFPI-2),又名胎盤蛋白-5,是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑。它能夠抑制細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的降解,抑制腫瘤新生血管的生成,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡,從而在抑制腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移等一系列生理病理過程中發(fā)揮重要的作用[2-3]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用甲基化酶抑制劑5-Aza-dC干預(yù)胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC1,觀察TFPI-2 mRNA、蛋白表達(dá)的變化及基因的甲基化狀態(tài)改變,探討胰腺癌的發(fā)生機(jī)制。

      材料與方法

      一、DNA抽提

      胰腺癌PANC1細(xì)胞系購自南京凱基生物公司,常規(guī)培養(yǎng)、傳代。1例正常胰腺組織取自安徽省立醫(yī)院普外科膽胰病區(qū)外傷剖腹探查者,征得患者及家屬同意,作為陰性對(duì)照。5-Aza-dC購自MERCK公司。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞,應(yīng)用1×10-7、5×10-7、1×10-6mol/L的5-Aza-dC處理PANC1細(xì)胞4 d,以未經(jīng)5-Aza-dC處理的PANC1細(xì)胞作為對(duì)照。采用DNA抽取試劑盒(天根公司)提取細(xì)胞及組織DNA。

      二、甲基化特異性PCR(MSP)

      取1 μg DNA,使用DNA修飾試劑盒(EPIGENTEK公司)進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾。采用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)MSP引物,甲基化引物上游5′-TTTCGTATAAAGCGGGTATTC-3′,下游5′-ACGACC-CGCTAAACAAAACG-3′;非甲基化引物上游5′-GGATGTTTGTTTTGTATAAAGTG-3′,下游5′-AAACATCCAAAAAAACACCTAAC-3′。引物由大連寶生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)條件:95℃ 20 min;94℃ 30 s、52℃ 30 s、72℃ 45 s,40個(gè)循環(huán);72℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳分離,凝膠成像系統(tǒng)掃描分析。

      三、RT-PCR

      取上述各組細(xì)胞及正常胰腺組織,用Trizol試劑(Gibco BRL公司)提取總RNA,紫外分光光度計(jì)檢測其濃度和純度。TFPI-2引物上游5′-CAGAATTCTATGGACCCCGCTCGCCCC-3′,下游5′-CAGTCG-ACTTAAAATTGCTTCTTCCG-3′。以β-actin作為內(nèi)參照。先逆轉(zhuǎn)錄cDNA,再行PCR,反應(yīng)條件:95℃ 5 min;94℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 30 s,30個(gè)循環(huán);72℃ 5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳分離,凝膠成像系統(tǒng)掃描,以目的基因條帶與β-actin條帶吸光值比值作為TFPI-2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

      四、蛋白質(zhì)印跡法

      取上述各組細(xì)胞及正常胰腺組織,采用RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑PMSF冰上裂解30 min。4℃離心取上清液,Bradford法行蛋白定量后再行蛋白質(zhì)印跡法檢測TFPI-2蛋白。TFPI-2單抗(Santa Cruz公司)工作濃度1∶500,HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG工作濃度1∶10000,最后ECL發(fā)光。以目的基因條帶與β-actin條帶吸光值比值作為TFPI-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

      五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

      結(jié) 果

      一、PANC1細(xì)胞TFPI-2基因甲基化狀態(tài)

      對(duì)照組細(xì)胞只有甲基化引物擴(kuò)增出條帶,為完全甲基化;1×10-7、5×10-7mol/L 5-Aza-dC處理的PANC1細(xì)胞甲基化及非甲基化引物均擴(kuò)增出條帶,為不完全甲基化;1×10-6mol/L 5-Aza-dC處理的PANC1細(xì)胞只有非甲基化引物擴(kuò)增出條帶,為非甲基化(圖1)。

      M:甲基化產(chǎn)物;U:非甲基化產(chǎn)物

      圖1空白對(duì)照(1)、正常胰腺(2)、PANC1細(xì)胞(3)及經(jīng)1×10-7、5×10-7、1×10-6mol/L 5-Aza-dC處理的PANC1細(xì)胞(4~6)的TFPI-2基因甲基化狀態(tài)

      二、各組PANC1細(xì)胞TFPI-2 mRNA表達(dá)

      PANC1細(xì)胞不表達(dá)TFPI-2 mRNA;1×10-7、5×10-7、1×10-6mol/L 5-Aza-dC處理后的PANC1細(xì)胞均表達(dá)TFPI-2 mRNA(圖2),相對(duì)表達(dá)量分別為0.211±0.087、0.327±0.068、0.609±0.017,兩兩濃度組間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.039、0.044)。

      三、各組PANC1細(xì)胞TFPI-2蛋白表達(dá)

      PANC1細(xì)胞不表達(dá)TFPI-2蛋白;1×10-7、5×10-7、1×10-6mol/L 5-Aza-dC處理后的PANC1細(xì)胞均表達(dá)TFPI-2蛋白(圖3),相對(duì)表達(dá)量分別為0.429±0.121、0.675±0.044、1.132±0.124,兩兩濃度組間的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.006、0.045)。

      圖2空白對(duì)照(1)、正常胰腺(2)、PANC1細(xì)胞(3)及經(jīng)1×10-7、5×10-7、1×10-6mol/L 5-Aza-dC處理的PANC1細(xì)胞(4~6)的TFPI-2 mRNA表達(dá)

      圖3空白對(duì)照(1)、正常胰腺(2)、PANC1細(xì)胞(3)及經(jīng)1×10-7、5×10-7、1×10-6mol/L 5-Aza-dC處理的PANC1細(xì)胞(4~6)的TFPI-2 蛋白表達(dá)

      討 論

      已經(jīng)有研究證實(shí),在多種腫瘤中TFPI-2的表達(dá)明顯減弱,甚至失活[4-9]。而導(dǎo)致該基因失活的主要原因可能是CpG島啟動(dòng)子區(qū)高甲基化的狀態(tài)。5-Aza-dC作為一種甲基化酶抑制劑,能與DNA甲基化酶共價(jià)結(jié)合,抑制該酶的甲基化轉(zhuǎn)移活性,逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的基因甲基化,恢復(fù)mRNA轉(zhuǎn)錄活性和蛋白表達(dá)。

      本研究結(jié)果顯示,未經(jīng)5-Aza-dC 處理的PANC1細(xì)胞TFPI-2基因啟動(dòng)子區(qū)為完全甲基化狀態(tài)。經(jīng)不同濃度5-Aza-dC處理后,細(xì)胞的TFPI-2基因的甲基化狀態(tài)得到了不同程度的逆轉(zhuǎn),TFPI-2 mRNA及蛋白的表達(dá)呈濃度依賴性地重新表達(dá),表明該藥物確能逆轉(zhuǎn)基因異常的高甲基化狀態(tài),并通過啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度的降低而恢復(fù)其轉(zhuǎn)錄活性,發(fā)揮其抑制腫瘤的作用。

      [1] 劉楓, 李兆中, 許國銘, 等. 特異性PCR法檢測胰腺癌p16基因甲基化改變. 胰腺病學(xué), 2002,2,82-84.

      [2] Du X, Chand HS, Kisiel W. Human tissue factor pathway inhibitor-2 does not bind or inhibit activated matrix metalloproteinase-1. Biochim Biophys Acta,2003,1621: 242-245.

      [3] Baker AH, Edwards DR, Murphy G. Metalloproteinase inhibitors: biological actions and therapeutic opportunities.J Cell Sci,2002,115:3719-3727.

      [4] Konduri SD, Srivenugopal KS, Yanamandra N, et al. Promoter methylation and silencing of the tissue factor pathway inhibitor-2(TFPI-2), a gene encoding an inhibitor of matrix metallo-proteinases in human glioma cells.Oncogene,2003,22:4509-4516.

      [5] Takada H,Wakabayashi N,Dohi O,et al.Tissue factor pathway inhibitor 2 (TFPI2) is frequently silenced by aberrant promoter hypermethylation in gastric cancer.Cancer Genet Cytogenet, 2010,197:16-24.

      [6] Guo H, Lin Y, Zhang H,et al.Tissue factor pathway inhibitor-2 was repressed by CpG hypermethylation through inhibition of KLF6 binding in highly invasive breast cancer cells.BMC Mol Biol,2007,8:110.

      [7] Nobeyama Y, Okochi-Takada E, Furuta J,et al. Silencing of tissue factor pathway inhibitor-2 gene in malignant melanomas.Int J Cancer,2007,121:301-307.

      [8] Gl?ckner SC, Dhir M, Yi JM,et al. Methylation of TFPI2 in stool DNA: a potential novel biomarker for the detection of colorectal cancer. Cancer Res,2009,69:4691-4699.

      [9] Tsunoda S, Smith E, De Young NJ, et al.Methylation of CLDN6, FBN2, RBP1, RBP4, TFPI2, and TMEFF2 in esophageal squamous cell carcinoma.Oncol Rep,2009,21:1067-1073.

      Effectof5-Aza-dConthemethylationandexpressionofTFPI-2geneinpancreaticcancerPANC1cellline

      TANGZhi-gang,ZHENGHao,HUANGQiang,CHENJiong.
      DepartmentofGeneralSurgery,AffiliatedProvincialHospital,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230001,China

      TANGZhi-gang,Email:tangzg7031@163.com

      ObjectivesTo investigate the effects of 5-aza-2-deoxycytidine(5-Aza-dC), a methylation inhibitor, on the expression and methylation of tissue factor pathway Inhibitor (TFPI-2) gene in PANC1 cell line of pancreatic cancer.MethodsPANC1 cell lines were treated with different dosages of 5-Aza-dC (1×10-7, 5×10-7, 1×10-6mol/L). The status of TFPI-2 methylation and expressions of TFPI-2 mRNA and protein were determined by MSP, RT-PCR, and Western blot.ResultsTFPI-2 gene CpG island was completely methylated, and there was no expression of TFPI-2 mRNA and protein without 5-Aza-dC treatment. After treatment with different dosages of 5-Aza-dC(1×10-7, 5×10-7, 1×10-6mol/L), TFPI-2 gene CpG hypermethylation was reversed from incomplete methylated to complete non-methylated. The relative expressions of TFPI-2 mRNA were 0.211±0.087, 0.327±0.068, 0.609±0.017; and the relative expressions of TFPI-2 protein were 0.429±0.121, 0.675±0.044, 1.132±0.124 in a dose-dependent manner (P<0.05).ConclusionsThe hypermethylation of promoter region may be the primary reason for TFPI-2 gene expression down-regulation and inactivation. 5-Aza-dC may reverse the hypermethylation of TFPI-2 gene, and induce the re-expression of TFPI-2 mRNA and protein.

      Pancreatic neoplasms; Methylation; Tissue factor pathway inhibitor 2; 5-Aza-dC

      10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.02.006

      國家自然科學(xué)基金(81071734)

      230001 合肥,安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院普外科

      湯志剛,Email:tangzg7031@163.com

      2011-05-27)

      (本文編輯:呂芳萍)

      猜你喜歡
      失活癌基因條帶
      抑癌基因P53新解讀:可保護(hù)端粒
      健康管理(2016年2期)2016-05-30 21:36:03
      基于條帶模式GEOSAR-TOPS模式UAVSAR的雙基成像算法
      探討抑癌基因FHIT在皮膚血管瘤中的表達(dá)意義
      抑癌基因WWOX在口腔腫瘤的研究進(jìn)展
      基于 Savitzky-Golay 加權(quán)擬合的紅外圖像非均勻性條帶校正方法
      草酸二甲酯加氫制乙二醇催化劑失活的研究
      河南科技(2015年2期)2015-02-27 14:20:35
      抑癌基因p53在裸鼴鼠不同組織中表達(dá)水平的差異
      一種基于MATLAB的聲吶條帶圖像自動(dòng)拼接算法
      海岸工程(2014年4期)2014-02-27 12:51:28
      冷凍脅迫下金黃色葡萄球菌的亞致死及失活規(guī)律
      Depulpin、三聚甲醛和砷牙髓失活劑的臨床療效比較
      吉木乃县| 呼图壁县| 涞源县| 佛教| 肃宁县| 新化县| 黑水县| 福海县| 昌平区| 奈曼旗| 射阳县| 游戏| 台南县| 浮山县| 承德县| 肃南| 汽车| 弥渡县| 水富县| 北流市| 石阡县| 蓬安县| 自贡市| 安乡县| 芦溪县| 平泉县| 吉首市| 敦煌市| 天全县| 体育| 普洱| 阿克陶县| 皮山县| 怀柔区| 简阳市| 白沙| 新沂市| 灵武市| 越西县| 平顺县| 南城县|