薛魁金 田字彬 孔心涓 王斌 魏良洲 張翠萍 趙清喜

刺參粘多糖對(duì)人胰腺癌細(xì)胞株SW1990增殖的抑制作用

薛魁金 田字彬 孔心涓 王斌 魏良洲 張翠萍 趙清喜

刺參粘多糖(stichopus japonicus acid muco-polysaccharide，SJAMP)是從中國刺參體壁中提煉出來的一類多糖類物質(zhì)。該物質(zhì)成分恒定，結(jié)構(gòu)簡單，易于克服空間位阻，增加了對(duì)黏膜上皮的穿透能力，容易被吸收。初步研究證實(shí)[1-4]，刺參粘多糖具有廣譜的抗腫瘤活性，能抑制肝癌、宮頸癌等惡性腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞分化。本研究觀察SJAMP對(duì)胰腺癌細(xì)胞SW1990增殖、凋亡的影響，探討其可能機(jī)制。

一、材料與方法

1．細(xì)胞培養(yǎng)：人胰腺癌細(xì)胞株SW1990為青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原微生物實(shí)驗(yàn)室保存，常規(guī)培養(yǎng)及傳代。 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2．四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法：以5×103個(gè)細(xì)胞(100 μl)接種于96孔板,待細(xì)胞生長至75%～80%融合時(shí)加入新鮮配置的SJAMP(中國海洋大學(xué)海洋藥物與生命研究所)，每孔100 μl，終濃度分別為0、2、4、8、16、32 mg/ml，設(shè)5個(gè)復(fù)孔。加藥24、48、72 h后，每孔加入5 mg/ml的MTT(Sigma公司)溶液20 μl，繼續(xù)避光培養(yǎng)4 h，吸去上清液，每孔加入100 μl二甲亞砜，室溫避光震蕩10 min。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定每孔492 nm波長的吸光值(A492值)。

3．細(xì)胞凋亡檢測(cè)：按照Annexin Ⅴ-PE+7-AAD凋亡檢測(cè)試劑盒(Millipore Guava technologies公司)說明書操作。將4×105個(gè)SW1990細(xì)胞(1 ml)接種于6孔板中,24 h后換液，加入新鮮配制的4 mg/ml的SJAMP 1 ml，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h，消化，收集細(xì)胞，移入離心管中， 4℃ 1500 r/min離心10 min，用100 μl無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，加入100 μl Guava Nexin Reagent避光孵育20 min，上Guava EasyCyte Mini 0500-1430流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

4．細(xì)胞周期的檢測(cè)：按照Guava?Cell Cycle Reagent細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒(Millipore Guava technologies公司)操作。將5×104個(gè)細(xì)胞(1 ml)的單細(xì)胞懸液接種于6孔板中，待細(xì)胞生長至75%～80%融合后換無血清RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，加入終濃度為2、4、8、16、32 mg/ml的SJAMP繼續(xù)培養(yǎng)24 h。胰酶消化、收集細(xì)胞，1000 r/min離心8 min，PBS洗滌1遍后以100 μl PBS重懸細(xì)胞，滴入-20℃的70%冰乙醇4℃固定過夜。離心，PBS洗滌后加入200 μl Guava?Cell Cycle Reagent重懸細(xì)胞，室溫孵育30 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布。

二、結(jié)果

1．細(xì)胞增殖的變化：SJAMP對(duì)SW1990細(xì)胞的生長具有明顯的增殖抑制作用(P<0.05，表1、圖1)。

表1 各組SW1990細(xì)胞的增殖抑制率

注：與0 mg/ml對(duì)照組比較，aP<0.05；bP<0.01

圖1 4 mg/ml SJAMP對(duì)人胰腺癌細(xì)胞SW1990的增殖抑制作用(×100)

2．細(xì)胞凋亡率的變化：4 mg/ml SJAMP處理SW1990細(xì)胞24、48、72 h的細(xì)胞凋亡率分別為(11.10±0.75)%、(21.30±0.91)%、(30.80±0.61)%，隨時(shí)間延長而逐漸增加，均顯著高于未用SJAMP處理同時(shí)間點(diǎn)的(3.50±0.34)%、(3.80±0.36)%、(4.40±026)%(P值均<0.01)。

3．細(xì)胞周期分布的變化：SJPAM處理后，細(xì)胞呈濃度依賴性被阻滯在G0/G1期，與對(duì)照組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或0.01)；在≥8 mg/ml SJPAM處理后，S期細(xì)胞及G2/M期細(xì)胞較對(duì)照組均顯著下降(P<0.01，表2)。

表2 各組細(xì)胞的周期分布

注：與0 mg/ml對(duì)照組比較，aP<0.05；bP<0.01

討論刺參屬棘皮動(dòng)物門海參綱刺參科，自古被視為佳肴珍品。刺參酸性粘多糖(SJAMP)是由刺參體壁提取的一種動(dòng)物酸性粘多糖。研究表明，SJAMP具有廣泛的生物活性，如抗凝血、降血脂、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗病毒等，其中抗腫瘤作用為近年研究的熱點(diǎn)。文獻(xiàn)報(bào)道[5]，SJAMP可明顯抑制鼠乳腺腫瘤細(xì)胞DNA的合成，使腫瘤細(xì)胞生長周期停滯，而對(duì)小鼠的正常肝細(xì)胞的DNA不僅沒有抑制作用，相反可以促進(jìn)正常肝細(xì)胞的有絲分裂。另有研究顯示，SJAMP可能通過調(diào)控細(xì)胞周期來發(fā)揮抑制HeLa細(xì)胞的增殖[6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SJAMP(>2 mg/ml)呈時(shí)間-劑量依賴性抑制SW1990細(xì)胞的增殖，增加SW1990細(xì)胞的凋亡，并使SW1990細(xì)胞阻滯于G0/G1期，推測(cè)SJAMP可能通過阻滯人胰腺癌SW1990細(xì)胞于G0/G1期而發(fā)揮其抑制細(xì)胞增殖的效應(yīng)，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

[1] Saftoleas MC,Moulakakis KG．Pancreatic cancer today．Hepatogastroenterology，2004，51：862-868．

[2] 蘇秀榕，婁永江，常亞青，等．海參的營養(yǎng)成分及海參多糖的抗腫瘤活性的研究．營養(yǎng)學(xué)報(bào),2003，25：181-182．

[3] 趙秀梅，馮文茹，高巍，等．刺參酸性粘多糖對(duì)HepA荷瘤的增效作用及其機(jī)制研究．時(shí)珍國醫(yī)國藥，2010，21：3062-3063．

[4] 陳玲，于壯，宋揚(yáng)．刺參粘多糖對(duì)人宮頸癌細(xì)胞凋亡的影響．奇魯醫(yī)學(xué)雜志，2009,24:95．

[5] 王振立，劉桂敏，鄭瑞，等．刺參粘多糖抑Nd,鼠腫瘤細(xì)胞DNA合成及其代謝研究．中國醫(yī)藥工業(yè)雜志,1993，24：405-408．

[6] 彭玲，于壯，宋揚(yáng).刺參黏多糖對(duì)Hela細(xì)胞增殖分化的影響.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，44：212.

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.02.021

266003 青島，青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科(薛魁金、田字彬、孔心涓、魏良洲、張翠萍、趙清喜)；青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院(王斌)

田字彬 Email: tianzb@qdumh.qd.sd.cn

2011-11-21)

(本文編輯：呂芳萍)