食管癌放射抗拒與P-gp、HER-2及microRNA-296表達(dá)的相關(guān)性*

朱 睿， 吳清明， 龍 輝， 程 靜， 李 歡

(1武漢科技大學(xué)，2武漢科技大學(xué)附屬天佑醫(yī)院，湖北 武漢 430064)

1000-4718(2012)03-0550-04

2011-10-09

2011-12-05

湖北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.2010CDB03505)

△通訊作者 Tel:027-51164093;E-mail:wuhe9224@sina.com

食管癌放射抗拒與P-gp、HER-2及microRNA-296表達(dá)的相關(guān)性*

朱 睿1， 吳清明2△， 龍 輝2， 程 靜2， 李 歡2

(1武漢科技大學(xué)，2武漢科技大學(xué)附屬天佑醫(yī)院，湖北 武漢 430064)

目的探討P-糖蛋白(P-gp)、人表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER-2)及microRNA-296的表達(dá)與食管癌放射抗拒的相關(guān)性。方法將人食管癌細(xì)胞Eca109分為對(duì)照組和處理組，處理組通過(guò)X射線反復(fù)照射(累計(jì)放射劑量60 Gy)，采用MTT法檢測(cè)2組細(xì)胞的增殖抑制率。免疫細(xì)胞化學(xué)法測(cè)定P-gp和HER-2的表達(dá)。Northern blotting法測(cè)定microRNA-296的表達(dá)。結(jié)果處理組細(xì)胞較對(duì)照組顯示出明顯的放射抗性，增殖抑制率明顯低于對(duì)照組細(xì)胞。免疫細(xì)胞化學(xué)測(cè)定P-gp和HER-2在處理組中較對(duì)照組表達(dá)顯著增加。2組細(xì)胞中microRNA-296表達(dá)無(wú)顯著差異。結(jié)論P(yáng)-gp、HER-2可能與食管癌放射抗拒有關(guān)；暫不能說(shuō)明microRNA-296與食管癌細(xì)胞Eca109放射抗拒具有相關(guān)性。

食管腫瘤; 放射抗拒; microRNA-296; 受體，人表皮生長(zhǎng)因子

食管癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)展迅速且預(yù)后較差[1]，全世界每年約有48萬(wàn)新發(fā)病例，隨著人口的增加，其發(fā)病總數(shù)還在不斷增加。其生物學(xué)特點(diǎn)具有侵潤(rùn)性、早期轉(zhuǎn)移和放、化療抵抗性[2]，對(duì)于其機(jī)制尚不明確。

P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)是由多藥耐藥基因1(multidrug resistance 1，MDR1)編碼的一種能量依賴跨膜糖蛋白，在多藥耐藥基因MDR1高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞中，表達(dá)顯著增加[3]，兩者間呈高度相關(guān)性。P-gp可通過(guò)穩(wěn)定線粒體膜電位，上調(diào)腫瘤細(xì)胞線粒體膜通透性而抑制X射線的凋亡效應(yīng)。

人表皮生長(zhǎng)因子受體 2(human epidermal growth facotr receptor 2,HER-2)是人表皮生長(zhǎng)因子受體家族中的重要成員之一，在很多惡性腫瘤中都表現(xiàn)為過(guò)表達(dá)或基因擴(kuò)增。HER-2通過(guò)PI3k/Akt通路，調(diào)節(jié)NF-κB活性以及c-Myc，發(fā)揮放射抗拒效應(yīng)。

微小RNA(microRNA)是一種廣泛存在于真核生物中、大小約21～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性單鏈小分子RNA[4]。這類(lèi)小分子在惡性腫瘤內(nèi)異常表達(dá)，通過(guò)抑制mRNA的降解和翻譯[5]發(fā)揮作用。MicroRNA-296(miR-296)是長(zhǎng)度為21 nt的微小RNA,具有胚胎干細(xì)胞特異性[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-296與食管癌化療耐藥性的發(fā)生有關(guān)[2]。到目前為止，尚沒(méi)有與食管癌放射抗拒的相關(guān)研究，本實(shí)驗(yàn)采用對(duì)食管癌Eca109細(xì)胞進(jìn)行反復(fù)照射，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生放射抗拒性，用以探討miR-296與食管癌放射抗拒是否相關(guān)。

材 料 和 方 法

1實(shí)驗(yàn)儀器

CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(Heal Force),倒置顯微鏡(Olympus)，超凈工作臺(tái)(蘇州凈化)，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(ELX800)，超速低溫離心機(jī)(Sigma)，37 ℃恒溫水浴箱(華普達(dá)公司)。

2細(xì)胞株及主要試劑

人食管癌細(xì)胞株Eca109(由太和醫(yī)院惠贈(zèng))；RPMI-1640培養(yǎng)粉(Gibco)，胰蛋白酶粉(Amresco)，新生胎牛血清(杭州四季青有限公司)，MTT、DMSO(Sigma)，P-gp單克隆抗體(鼠抗人)、HER-2單克隆抗體(兔抗人)均購(gòu)自Santa Cruz，SP試劑盒(北京中杉生物技術(shù)有限公司)。

3主要方法

3.1細(xì)胞培養(yǎng) 人食管癌Eca109細(xì)胞株常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素及1×105U/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

3.2食管癌細(xì)胞株的處理 采用Varian 2300直線加速器6MV-X線照射，表面加1.5 cm標(biāo)準(zhǔn)等效填充物，放射源至標(biāo)本距離100 cm，照射野10 cm×10 cm，吸收劑量率為1.5 Gy/min。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的親本Eca109細(xì)胞X射線照射8 Gy，立即放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，待照射后的細(xì)胞增長(zhǎng)至接近長(zhǎng)滿瓶底時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，重新接種培養(yǎng)。細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期后，再次X射線照射8 Gy。重復(fù)以上過(guò)程，累計(jì)照射劑量至60 Gy后進(jìn)行檢測(cè)[7]。

3.3MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)定增殖抑制率 取對(duì)照組(未處理食管癌Eca109細(xì)胞)和處理組(X射線處理)同時(shí)給予0、2、4、6、8 Gy的劑量照射。照射完畢后，立即制成細(xì)胞懸液，按5 000 cells/well接種于96孔板，6個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)空白組(無(wú)細(xì)胞的培養(yǎng)液)，5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)。于72 h加入5 g/L MTT 20 μL，37℃繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)。小心吸去孔內(nèi)上清液，加入DMSO 150 μL，置搖床上振蕩10 min，使結(jié)晶體充分溶解，在酶標(biāo)儀上選擇490 nm濾光片測(cè)定A值，并記錄結(jié)果。

3.4細(xì)胞免疫組化 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的對(duì)照組和處理組細(xì)胞，按5×107cells/L的細(xì)胞密度接種于6孔板中已滅菌處理的蓋玻片上，每孔2 mL，孵育24 h后取出蓋玻片，4%多聚甲醛固定，3%H2O2-甲醇去除內(nèi)源性過(guò)氧化酶活性，10%正常山羊血清封閉15 min，分別加入鼠抗人P-gpⅠ抗、兔抗人HER-2Ⅰ抗，4 ℃濕盒過(guò)夜，加入相應(yīng)的Ⅱ抗，DAB顯色，置于顯微鏡下觀察，待顯色充分后，流水沖洗終止反應(yīng)。蘇木素復(fù)染，鹽酸乙醇分化，二甲苯透明，樹(shù)膠封片，鏡下觀察，照相。P-gp蛋白陽(yáng)性產(chǎn)物主要位于細(xì)胞漿，HER-2蛋白陽(yáng)性產(chǎn)物主要位于細(xì)胞膜，在顯微鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野的細(xì)胞。免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果判定按文獻(xiàn)介紹的染色強(qiáng)度指數(shù)計(jì)算法，綜合陽(yáng)性細(xì)胞及染色強(qiáng)度所占百分比2個(gè)方面進(jìn)行半定量分析。染色強(qiáng)度評(píng)分：0分：無(wú)或染色極淡(陰性-)；1分：淺棕黃色(弱陽(yáng)性+)；2分：棕黃色(陽(yáng)性++)；3分：棕褐色(強(qiáng)陽(yáng)性+++)。陽(yáng)性細(xì)胞百分比(A、B、C、D)分別是-、+、++、+++各種染色強(qiáng)度細(xì)胞的百分比。染色強(qiáng)度指數(shù)=A×0+B×1+C×2+D×3。

那么，什么是“危機(jī)意識(shí)”呢？ 在此，就必須與徐復(fù)觀先生所提出的“憂患意識(shí)”進(jìn)行對(duì)比分析。 所謂“憂患意識(shí)”，首先，它不是來(lái)源于對(duì)人所無(wú)法解決的末日的恐怖與對(duì)神的拯救的祈求，而是通過(guò)現(xiàn)實(shí)的人的行為去尋求解決當(dāng)前困境或即將發(fā)生的困境的思路，以一種預(yù)見(jiàn)或假設(shè)的方式為其規(guī)劃自己尚未實(shí)行的實(shí)際行為以求得對(duì)困境的解決。 正因?yàn)橛兄F(xiàn)實(shí)存在的社會(huì)憂患，身為當(dāng)事者的人才會(huì)對(duì)此進(jìn)行一種反應(yīng)，并在不斷的預(yù)設(shè)中發(fā)現(xiàn)自身行為對(duì)結(jié)果所產(chǎn)生的影響。 從而產(chǎn)生出對(duì)自身行為及行為所能夠引發(fā)的結(jié)果的重視，即責(zé)任感。[5]85-89

3.5Northern blotting檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的對(duì)照組和處理組食管癌Eca109細(xì)胞，按Trizol操作手冊(cè)提取細(xì)胞總RNA后，用紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖電泳檢測(cè)RNA的完整性。準(zhǔn)備12% 7 mol/L尿素變性膠，在0.5×TBE中350～400V預(yù)電泳1 h，每組樣品各15 μL總RNA上樣，電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)電泳至4/5處停止電泳；半干轉(zhuǎn)印至尼龍膜；1 200 mJ UV照射；膜于57℃預(yù)雜交30min；然后在雜交液中加入100 μg/L的miR-296探針(按照Roche的Dig Oligonucleotide 3’-End Labeling Kit的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行地高辛標(biāo)記)，雜交過(guò)夜。雜交結(jié)束后室溫下5%SDS，1×SSC洗10 min，57 ℃下同樣溶液洗3次，壓磷屏過(guò)夜，Typhoon同位素成像儀(GE)掃描同位素信號(hào)。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

12組細(xì)胞增殖抑制率變化

2組細(xì)胞在放療72 h后，處理組的細(xì)胞增殖抑制率明顯低于對(duì)照組(P<0.05),見(jiàn)表1，說(shuō)明處理組細(xì)胞比對(duì)照組放射敏感性低，具有一定的放射抗拒性。

表1 放療后的增殖抑制率

P-gp陽(yáng)性染色主要位于胞膜和胞漿，HER-2陽(yáng)性染色主要位于胞膜，2組細(xì)胞中P-gp和HER-2均有表達(dá)，見(jiàn)圖1、2。根據(jù)文獻(xiàn)查閱細(xì)胞免疫化學(xué)染色指數(shù)評(píng)定，P-gp在對(duì)照組染色強(qiáng)度指數(shù)為0.718±0.123，處理組染色強(qiáng)度指數(shù)為1.524±0.423；HER-2在對(duì)照組染色強(qiáng)度指數(shù)為0.402±0.089，處理組染色強(qiáng)度指數(shù)為1.196±0.230，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

Figure 1. The expression of HER-2 in esophageal squamous carcinoma cells Eca109(×200).A: control group; B: treatment group.

圖1HER-2在食管癌細(xì)胞Eca109中的表達(dá)

Figure 2. The expression of P-gp in esophageal squamous carcinoma cells Eca109(×200).A: control group; B: treatment group.

圖2P-gp在食管癌細(xì)胞Eca109中的表達(dá)

3Northernblotting檢測(cè)miR-296的表達(dá)

2組細(xì)胞中均有miR-296表達(dá)，見(jiàn)圖3，由于U6基因含量的穩(wěn)定性，選取U6作為非特異性基因條帶，與miR-296特異性基因條帶進(jìn)行密度比值分析，對(duì)照組miR-29相對(duì)值為0.032500±0.001590，處理組的相對(duì)值為0.034127±0.003151，兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

Figure 3. The miR-296 expression detected by Northern blotting.1,3,5：control group; 2,4,6：treatment group.

圖3Northernblotting檢測(cè)miR-296的表達(dá)

討 論

目前我們對(duì)于食管癌的診治情況較前取得了很大的改善，但其5年生存率仍在20%左右。導(dǎo)致腫瘤治療失敗的原因是腫瘤細(xì)胞對(duì)治療的抵抗性以及腫瘤的局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[6]。放射抗拒是一個(gè)多基因參與的過(guò)程，前期我們?cè)谑彻馨┑姆派淇咕軝C(jī)制方面的研究中，推測(cè)食管癌的放射抗拒性與MDR1/P糖蛋白等有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)分次照射、克隆培養(yǎng)，得到具有放射抗性的處理組細(xì)胞。MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)2組細(xì)胞的增殖抑制率，結(jié)果顯示處理組細(xì)胞株的增殖抑制率低，即放射敏感性低。免疫細(xì)胞化學(xué)法2組細(xì)胞中P-gp和HER-2均有表達(dá)，但處理組細(xì)胞中，兩者表達(dá)顯著增加(P<0.01)。進(jìn)一步證實(shí)了處理組細(xì)胞的放射抗性。HER-2的過(guò)表達(dá)對(duì)乳腺癌放射抗拒性的產(chǎn)生已有證實(shí)，而對(duì)于HER-2的過(guò)表達(dá)與食管癌中的放射抗拒性尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)，提示HER-2可能與食管癌放射抗拒有關(guān)。

Hristo等[6]采用Northern blotting分析胚胎干細(xì)胞中microRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-296具有胚胎干細(xì)胞特異性。Hong等[2]在食管癌旁組織、食管原位癌及食管鱗狀細(xì)胞癌中測(cè)定miR-296有表達(dá)，且呈遞增型。說(shuō)明miR-296可能與食管癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。并且指出，miR-296與食管癌的化療耐藥相關(guān)，其機(jī)制是因?yàn)镸DR1 可能是miR-296的目標(biāo)調(diào)節(jié)基因，下調(diào)miR-296，MDR1的表達(dá)隨之下調(diào)。對(duì)于miR-296與食管癌的放射抗拒是否相關(guān)，目前暫無(wú)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用Northern blotting測(cè)定食管癌細(xì)胞和X射線誘導(dǎo)出有一定放射抗性的細(xì)胞中miR-296的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)兩者間并無(wú)明顯差異(P>0.05)，暫不能說(shuō)明miR-296與放射抗拒間具有相關(guān)性。

分析其原因，可能有以下幾種情況：其一，miR-296與食管癌放射抗拒確無(wú)相關(guān)性，不參與食管癌放射抗拒機(jī)制的產(chǎn)生。MiR-296調(diào)節(jié)MDR1，而MDR1與P-gp高度相關(guān)，但有文獻(xiàn)[8]指出，MDR1基因擴(kuò)增并不總是能促進(jìn)蛋白的過(guò)度表達(dá)，而蛋白的過(guò)度表達(dá)也不一定依賴基因擴(kuò)增引起，兩者之間存在著其它未知的作用機(jī)制參與MDR1的轉(zhuǎn)錄、翻譯的調(diào)控。其二，miR-296與食管癌放射抗拒相關(guān)。但放射抗拒的產(chǎn)生是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，有多種基因參與。射線照射后，會(huì)立即出現(xiàn)一系列快速反應(yīng)蛋白，而在后期表達(dá)恢復(fù)。miR-296可能參與射線照射后的快速反應(yīng)機(jī)制。其三，DNA也具有自我修復(fù)功能，對(duì)于紫外照射所形成的DNA堿基二聚體，例如T-T二聚體，細(xì)胞可通過(guò)光修復(fù)作用解聚或切除修復(fù)。另外，文獻(xiàn)顯示[9]人腦腫瘤的血管內(nèi)皮細(xì)胞相比正常腦血管內(nèi)皮細(xì)胞，miR-296的表達(dá)升高。在體內(nèi)異種移植miR-296抑制物，血管生成減少。此外，在NIH3T3細(xì)胞中，經(jīng)UVB照射后，miR-296表現(xiàn)為低表達(dá)。說(shuō)明miR-296可能參與DNA的損傷修復(fù)[10]。

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ExpressionofP-gp,HER-2andmicroRNA-296isassociatedwithradiationresistanceinesophagealcarcinoma

ZHU Rui1, WU Qing-ming2, LONG Hui2, CHENG Jing2, LI huan2

(1WuhanUniversityofScienceandTechnology,2TianyouHospitalAffiliatedtoWuhanUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430064,China.E-mail:wuhe9224@sina.com)

AIM: To investigate whether the expression of P-glycoprotein (P-gp),human epidermal growth factor receptor 2(HER-2)and microRNA-296 is associated with the radiation resistance in esophageal cancer.METHODSThe human esophageal squamous carcinoma cell line Eca109 was divided into control group and treatment group. The cells in treatment group were irradiated by X-ray repetitiously (cumulative radiation dose 60 Gy). The difference of the cell proliferation inhibition between the 2 groups was determined by MTT assay. The expression of P-gp and HER-2 in the cells was detected by immunocytochemical method. The differential expression of microRNA-296 in the cells of the 2 groups were identified by Northern blotting.RESULTSCompared with control group, a clear radiation resistance and lower growth inhibition were observed in treatment group. The expression of P-gp and HER-2 in treatment group increased significantly than that in control group. No significant difference of microRNA-296 expression between the 2 groups was observed.CONCLUSIONP-gp and HER-2 are relevant with radiation resistance in esophageal cancer. No significant association between microRNA-296 and radiation resistance in Eca109 cells is showed.

Esophageal neoplasms; Radiation resistance; microRNA-296; Receptors,human epidermal growth factor

R735.1

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.03.030