陳志宏 鄭 鈴 劉新銳 謝寶貴

(福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院菌物研究中心,福州 350002)

草菇 (Volvariella volvaeea),又名苞腳菇、麻菇、貢菇、稈菇等,在歐美國家被稱為稻草蘑菇、中國蘑菇[1]。草菇喜溫、喜濕,因自然發(fā)生于稻草上而得名[2]。

生產(chǎn)實(shí)踐表明,與其他食用菌相比,草菇菌種最容易發(fā)生變異。遺傳和變異是生物的基本特性,是一對矛盾,育種工作者希望獲得大量的變異個體,才能從中篩選出優(yōu)良品種,而良種繁育則不希望菌種發(fā)生變異。食用菌科技工作者耗費(fèi)了大量人力、物力和財力培育出來的優(yōu)良品種,保持品種的優(yōu)良特性、避免變異,是良種保藏繁育的主要目標(biāo)和任務(wù)。菌種保藏不僅要保持菌種不死亡、不被雜菌污染,而且要保持菌種遺傳性狀不發(fā)生或盡少發(fā)生變異。

現(xiàn)有的菌種保藏常采用控制溫度、水活度、氧氣和營養(yǎng)等方法,讓菌種處于休眠狀態(tài),降低或抑制食用菌的生長代謝,減少發(fā)生變異,達(dá)到菌種保藏的目的[2]。大多數(shù)食用菌菌種可以通過低溫來保藏,但草菇是一種高溫型食用菌[3],在低溫 (4℃以下)下存放會死亡,而在較高的溫度下保藏,又常發(fā)生變異。本研究進(jìn)行包括超低溫液氮保藏在內(nèi)的4種保藏方法的試驗(yàn),以期篩選出草菇菌種保藏的適用技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 菌種來源 試驗(yàn)所用的草菇菌種V0049、PYd15和H1521均由福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心提供。

1.2 傳代保藏 供試菌株在PDA斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng),菌絲長滿斜面后放于30℃下保藏2個月。

1.3 無菌水保藏 菌落剛長滿培養(yǎng)皿時,用直徑0.5 cm打孔器在以接種塊為中心,半徑3 cm的圓弧線上打取接種塊,放入凍存管,每管5塊,注入無菌水 (蒸餾水),密封凍存管管蓋,30℃下保藏2個月。

1.4 礦油保藏 菌落剛長滿培養(yǎng)皿時,用直徑為0.5 cm打孔器在以接種塊為中心,半徑3 cm的圓弧線上打取接種塊,放入凍存管,每管5塊,注入礦油,密封凍存管管蓋,30℃下保藏2個月。

1.5 液氮保藏 與礦油保藏方法相似,在凍存管內(nèi)注入經(jīng)滅菌的10%甘油作為保護(hù)劑,密封凍存管管蓋,隨后作降溫處理。降溫程序?yàn)椋簭?5℃至4℃,降溫速率為9℃/min;4℃至-40℃,降溫速率為 1℃/min;而后直接垂直降溫至-196℃,放入液氮中凍存2個月。解凍方法為35℃處理5 min。

1.6 菌種保藏效果檢測 經(jīng)過2個月的保藏,菌種塊在接種之前先用無菌濾紙吸干保護(hù)劑 (無菌水、礦油或甘油,傳代培養(yǎng)則直接接種),然后接種于PDA平板培養(yǎng)基中央,在35℃下培養(yǎng),記錄菌絲萌發(fā)時間、菌絲生長速度,并計算菌絲生長的平均速度。

2 結(jié)果與分析

試驗(yàn)菌株V0049、PYd15和H1521采用4種不同方法保藏2個月后,解凍活化培養(yǎng)的結(jié)果表明：4種保藏方法菌種萌發(fā)率都達(dá)到100%,萌發(fā)時間略有差異,但不是很明顯。菌絲生長速度和長勢以液氮超低溫保藏較好,其次為蒸餾水和礦油,傳代保藏效果較差 (表1,圖1)。

表1 不同保藏方法的菌絲生長情況

3 討論與結(jié)論

食用菌種質(zhì)資源保藏方法雖多,但基本原理都是使菌絲處于代謝微弱、生長受抑制的環(huán)境中。低溫、干燥和隔絕空氣是使微生物代謝能力下降的重要措施[4]。液氮超低溫保藏是將菌種保藏在-196℃的液態(tài)氮中,使菌種的生命代謝停止。因此,自1968年Hwang首先應(yīng)用液氮保藏食用菌以來,液氮保藏因其突出的優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用。該方法可長期保存菌種,已被認(rèn)為是最有效、安全的保藏方法[5,6],但是與超低溫液氮保藏方法相比,礦油和無菌水的保藏方法具有成本低、操作方便等優(yōu)點(diǎn),更適合廣大菇農(nóng)使用。

本試驗(yàn)結(jié)果表明,液氮菌種保藏具有一定優(yōu)勢,但是為進(jìn)一步優(yōu)化草菇液氮保藏條件,液氮保藏的降溫程序、有效溫度范圍等尚需進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)中液氮保藏效果最好,但費(fèi)用昂貴,不僅需要購置液氮罐,而且在菌種保藏過程中每個月都要注1～2次液氮。礦油或無菌水保藏的性價比較高,無需添置設(shè)備,試劑低廉,建議推廣使用。

圖1 菌株H1521不同保藏方法菌絲生長情況

[1]黃 毅.食用菌栽培學(xué)(第三版)[M].高等教育出版社.2008,7.

[2]張瑞穎,胡丹丹,左雪梅.食用茵菌種保藏技術(shù)研究進(jìn)展[D].食用菌學(xué)報.2010.17(4)：84～88.

[3]李 剛.草菇分子標(biāo)記輔助育種研究[D].福州：福建農(nóng)林大學(xué),2008.

[4]MORTEN c,SANJEEB B.SHIVA D.et a1.Collection and use of wild ediblefungi[M].Nepal：EconomicBotanybySpringer New York.2008：12.23.

[5]黃 河,徐大雅.液氮保存疫霉屬菌種存活期檢測[J].真菌學(xué)報,1993,12(1)：48-53.

[6]劉新銳,葉 夏,王玉青,宋秀高,陳傳明,謝寶貴.香菇菌種液氮保藏技術(shù)研究 [J].熱帶作物學(xué)報,2011,32(7)：1360-1363.