江曉凌 馬 璐 應正河 林衍銓

(福建省農業(yè)科學院食用菌研究所,福州 350014)

繡球菌 (Sparassis crispa),又名繡球蕈、繡球菇,隸屬于擔子菌亞門、異隔擔子菌綱、無 (非)褶菌目、繡球菌科、繡球菌屬,因其形似巨大繡球而得名。其子實體潔白,菌肉脆嫩,風味獨特,似茴香味,營養(yǎng)豐富,其名貴程度不亞于冬蟲夏草、羊肚菌、塊菌等珍品菌類。

繡球菌不僅味道鮮美,而且營養(yǎng)價值高,特別是子實體中含有的β-葡聚糖能提高人體免疫力[1]及機體造血功能[2],具有抗癌[2,3]、防癌[4,5]、抗艾滋病 (JP 2003265139-A)等特殊功效,對某些腫瘤也有一定的預防和抑制作用。通過深層培養(yǎng),繡球菌可產生對某種真菌具有拮抗作用的繡球菌醇(Sparassol)[6]。繡球菌在國內主要分布于云南、西藏、黑龍江、吉林[7],國外主要分布于美國、加拿大、澳大利亞、英國南部以及日本的本州、四國、北海道等地區(qū)[8～10]。雖然分布很廣,但其野生數量稀少,產量也非常有限,難以滿足市場的需求。同時繡球菌的生長發(fā)育對其營養(yǎng)生理、生態(tài)條件的要求較一般食用菌類高,人工栽培難度較大。近年來隨著對繡球菌研究的深入,特別是對其抗腫瘤、防癌抗癌功能認識的不斷提高,繡球菌已日益受到人們的重視,而野生資源蘊藏量短缺,對其進行規(guī)?；斯ぴ耘嘁殉蔀楸厝弧Ｒ虼?本試驗對影響繡球菌菌絲生長的溫度、濕度、pH值等條件進行研究,以期為人工規(guī)?；耘嗵峁├碚摶A。

1 材料與方法

1.1 供試菌株 4個供試繡球菌菌株A、B、C、D,均為福建省農業(yè)科學院食用菌研究所保藏。

1.2 試驗方法

(1)菌種活化與接種物準備。取待試驗斜面菌種,挑取一小塊于斜面PDA培養(yǎng)基上,在25℃下培養(yǎng),待長滿管時 (T1),轉接于斜面培養(yǎng)基上,23℃下培養(yǎng)至滿管 (T2)。每個90 mm的培養(yǎng)皿上加入20 mL經滅菌的PDA培養(yǎng)基,水平放置,制成平板培養(yǎng)基。挑取T2斜面前端菌種轉接到平板培養(yǎng)基上,置于23℃下培養(yǎng)。當菌落直徑長至4～6 cm時,在同一直徑的圓圈上,用直徑為7 mm的打孔器打出相同的若干菌種塊 (T3)。

(2)溫度試驗。①取T3菌種塊接種到平板培養(yǎng)基 (培養(yǎng)皿直徑90 mm)中間,接種塊菌絲面朝上,置于23℃下培養(yǎng)。②當菌落直徑長至1～2 cm時,在菌落邊緣畫線作為生長起始線。③把這些培養(yǎng)皿分別置于10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃溫度下培養(yǎng),每處理設5個重復。當生長速度最快的培養(yǎng)皿菌絲即將長滿時,取出所有培養(yǎng)皿,在菌落邊緣畫一條終止線,測量起始線與終止線之間的距離,計算菌絲生長速度,取平均值。確定菌絲生長的溫度范圍與最適生長溫度。

將未生長菌絲的處理,再放回23℃下繼續(xù)培養(yǎng)5～7天,如果還是沒有生長,說明菌絲體已死亡,預將該溫度作為菌絲的致死溫度。將上述得到的致死溫度往前推10℃,每間隔2℃設一溫度梯度,按①、②步驟,接種后的培養(yǎng)皿置于各溫度梯度下培養(yǎng)8 h,然后取出于23℃下繼續(xù)培養(yǎng)5～7天,如果菌絲停止生長,說明菌絲體已死亡。從而得到菌絲的致死溫度和生長限制溫度的準確值。

(3)培養(yǎng)料含水量試驗。①取烘干的栽培料(原料均在60℃下烘干至恒重),以45%～75%范圍,間隔5%,設定培養(yǎng)料含水量梯度,每處理設5個重復。將各處理培養(yǎng)料裝入25×200(mm)的試管中,每支試管裝干料20 g,裝料高度一致。塞上棉花塞,用牛皮紙包好,倒置進行高壓滅菌 (注意須避免滅菌后排氣過快),備用。②取T3菌種塊接種到栽培料試管中,接種塊的菌絲面朝上。若滅菌后料面干燥,可在接種前于料面滴加無菌水2～3 mL。接種后置于23℃下培養(yǎng)。③于菌絲吃料1～2 cm時,在菌絲前緣畫線作為生長起始線。④畫線后的試管放回同一生化培養(yǎng)箱培養(yǎng),當菌絲長速最快的試管即將長滿管時,取出所有試管,在菌絲前緣畫一條終止線,測量起始線與終止線之間的距離,計算菌絲生長速度,確定菌絲生長的濕度范圍和最適培養(yǎng)料濕度。

(4)pH試驗。①母種培養(yǎng)基pH的調整：配制PDA培養(yǎng)基,分裝于50mL的三角瓶中,每瓶裝20 mL。高壓滅菌后,取數個培養(yǎng)基未凝固的三角瓶,置于50℃的水浴鍋內用1 N HCL或1 N NaOH調節(jié)pH值,準確記錄調到各pH值所需HCL或NaOH的量,然后在超凈工作臺內對各瓶內的培養(yǎng)基進行pH值調節(jié),隨后立即于每瓶中倒入平板培養(yǎng)基(培養(yǎng)皿直徑90 mm)。pH值范圍取2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,每pH值設5個重復。②取T3菌種塊接種到已調好pH的平板培養(yǎng)基中間,置同一生化培養(yǎng)箱中于23℃下培養(yǎng)。③在菌落直徑為1～2 cm時,在菌落邊緣畫線作為生長起始線。④在23℃下繼續(xù)培養(yǎng),當長速最快的三角瓶菌絲快長滿時,取出所有培養(yǎng)皿,在菌絲邊緣畫一條終止線。測量起始線與終止線之間的距離,計算菌絲生長速度,確定菌絲生長的pH范圍與最適pH值。

(5)栽培料中添加不同比例石灰和過磷酸鈣對菌絲生長的影響試驗。①在棉籽殼木屑培養(yǎng)基中添加石灰或過磷酸鈣,其石灰添加量分別為5%、4%、3%、2%、1%、0,過磷酸鈣添加量為1%、2%、3%、4%、5%。須注意的是,配方中主料(棉籽殼和木屑)應相應減少,使各組分相加后為100%。每處理設5個重復。將各處理培養(yǎng)料裝入25×200(mm)的試管中,每試管裝干料20 g,裝料高度一致。塞上棉花塞,用牛皮紙包好,倒置進行高壓滅菌 (注意避免滅菌后排氣過快),備用。其他步驟同pH值試驗②～④。最后通過計算菌絲生長速度,確定培養(yǎng)料中石灰和過磷酸鈣的最適添加量。

2 結果與分析

2.1 4個繡球菌菌絲生長的適宜溫度 試驗結果(表1)表明,繡球菌菌絲在15～28℃下均能生長;在10℃和30℃及以上時不生長。從生長勢看,當溫度為25℃時,菌絲濃密、健壯、長勢好。超過30℃菌絲基本停止生長,持續(xù)時間長會致菌絲體死亡。因此,繡球菌菌絲體生長的最適溫度為25℃,致死溫度為30℃。

表1 溫度對4個繡球菌菌絲生長的影響

2.2 4個繡球菌菌絲生長的適宜培養(yǎng)料濕度 從表2可知,菌絲在含水量為45%～75%的培養(yǎng)料中均能生長。其中,含水量在65%～75%時,菌絲的生長顯著優(yōu)于其他含水量。隨著含水量的下降,各菌株的菌絲長速和生長勢也降低。菌株A的菌絲生長最適培養(yǎng)料濕度為75%,菌株B、C、D的最適培養(yǎng)料濕度為65%。

2.3 4個繡球菌菌絲生長的適宜pH值 從表3可以看出,繡球菌菌絲在初始pH 5.0～8.8的范圍內都能正常生長,其中,菌株A的菌絲在pH為4.0時也能生長。當培養(yǎng)基pH為7.0和8.0時,各菌株菌絲生長濃密,長勢較佳。當pH為9.0及以上時,各菌株菌絲均不生長。

表2 濕度對4個繡球菌菌絲生長的影響

表3 平板pH對4個繡球菌菌絲生長的影響

2.4 培養(yǎng)料中石灰、過磷酸鈣適宜添加量 由表4可知,4個繡球菌菌絲在添加了1%～5%的過磷酸鈣或石灰的栽培料中都能生長,其中以添加了3%石灰的培養(yǎng)料中的生長勢最旺盛,菌絲濃密。因此,栽培料最適添加3%石灰。

表4 栽培料pH對4個繡球菌菌絲生長的影響

3 小結與討論

3.1 繡球菌A、B、C、D菌絲在15～28℃溫度范圍內均能生長,最適生長溫度為25℃。在pH 5.0～8.0范圍內,各菌株菌絲均能正常生長,最適pH為7.0,pH≥9.0時不能生長;菌絲在含水量為45%～75%的栽培料中均能生長,其最適含水量菌株A為75%,B、C、D均為65%。在栽培料中添加1%～5%的石灰或過磷酸鈣,4個菌株的菌絲均能生長,其最適添加量為石灰3%。

3.2 生物學特性觀察結果顯示,在不同溫度、濕度和pH值條件下,4個繡球菌菌株的菌絲生長差異不是十分明顯。但菌株C的菌絲長勢較其他3個菌株旺盛。

3.3 繡球菌菌株與金頂側耳、牛排菌和紅平菇等其他珍稀食藥兼用真菌相比,其菌絲生長速度較慢,制種周期較長,有必要改良菌株特性或改進制種技術以滿足生產需求。

[1]Ohno N.,Nameda S.,Harada T.,et al.Immunomodulating activity of a b-glucan preparation,SCG,extracted from a culinary-medicinal mushroom,Sparassis crispa Wulf.：Fr.(Aphyllophoromycetidae),and application to cancer patients[J].International Journal of Medicinal Mushrooms,2003,5359-368.

[2]Ohno N.,Miura N.,Nakajima M.,et al.Antitumor1,3-β-glucan from cultured fruit body of Sparassis crispa[J].Biological&Pharmaceutical Bulletin,2000,23(7)：866-872.

[3]Kurosumi A.,Kobayasi F.,Mtui G.,et al.Development of optimal culture method of Sparassis crispa mycelia and a new extraction method of antineoplastic constituent[J].Biochemical Engineering Journal,2006,30(1)：109-113.

[4]Hasegawa A.,Yamada M.,Dombo M.,et al.Sparassis crispa as biological response modifier[J].癌と化學療法,2004,31(11).

[5]Ohno N.,Harada T.,Masuzawa S.,et al.Antitumor Activity and Hematopoietic Response of a b-Glucan Extracted from an Edible and MedicinalMushroom Sparassis crispa Wulf.：Fr.(Aphyllophoromycetideae)[J].Journal of Porous Media,2008,11(4).

[6]Woodward S.,Sultan H.,Barrett D.,et al.Two new antifungal metabolites produced by Sparassis crispa in culture and in decayed trees[J].Microbiology,1993,139(1)：153.

[7]張光亞.中國常見食用菌圖鑒 [J].昆明：云南科技出版社,1999,109.

[8]朱斗錫,何榮華.珍稀名貴繡球菌的經濟價值及開發(fā)前景[J].食用菌,2008,(003)：8.

[9]黃建成,應正河,余應瑞,等.繡球菌菌絲營養(yǎng)生理特性研究[J].食用菌學報,2007,14(003)：33-36.

[10]黃建成,李開本,林應椿,等.繡球菌子實體營養(yǎng)成分分析[J].營養(yǎng)學報,2007,29(005)：514-515.