肖 苑，李文娜，黃燮南，陳 陽

(遵義醫(yī)學院珠海校區(qū)，廣東 珠海 519041)

遵義杜仲葉綠原酸提取工藝的優(yōu)化研究

肖 苑，李文娜，黃燮南，陳 陽

(遵義醫(yī)學院珠海校區(qū)，廣東 珠海 519041)

目的優(yōu)化杜仲葉中綠原酸的提取工藝。方法以綠原酸提取率為指標，通過單因素和正交實驗優(yōu)選提取方法與工藝參數。結果當乙醇濃度為60%、料液比為1∶12、pH=5、提取時間為30 min時，在超聲頻率25kHz的條件下提取2次，綠原酸的得率為2.54%,較用其他各組參數提取的得率高。結論杜仲葉中綠原酸的最佳超聲提取工藝為：以60%乙醇為溶劑、料液比為1∶12、pH=5，提取時間30 min。

杜仲葉；綠原酸；提取工藝

杜仲(EucommiaulmoidesOliv.)是我國常用的中藥材之一，對杜仲的深入研究具有廣泛的應用前景。已知杜仲葉與杜仲皮的化學成分，特別是藥效成分基本一致【1】。因杜仲葉適當采收后可再發(fā)新葉，就實現資源的可循環(huán)利用而言，對杜仲葉中藥物成分的研究、優(yōu)化提取工藝、提高有效成分得率，具有十分重要的實際意義。綠原酸(chlorogenic acid)是杜仲葉中苯丙素類化合物的主要有效成分之一，具有抗氧化、保護心血管、抑制突變、抗菌抗病毒及抗腫瘤等作用【2】。為提高其開發(fā)利用價值，本文以貴州遵義產杜仲葉為原料，采用正交試驗，對綠原酸的提取工藝進行了優(yōu)化。

1 實驗部分

1.1 儀器與試藥 UV-2550紫外分光檢測器(日本島津)； HS3120型超聲波清洗機(天津恒高有限公司)；HHW21-600型電熱恒溫水浴箱(北京長源實驗設備廠)； FZl02微型植物試樣粉碎機(黃驊市中興儀器有限公司)； PHSJ-5型數顯PH計(上海精密科學儀器有限公司)； 722型可見分光光度計(上?，F科分光儀器有限公司)；杜仲葉(貴州省遵義市中藥藥材站)；綠原酸對照品(中國藥品生物制品檢定所)；其他試劑均為分析純。

1.2 方法與結果

1.2.1 杜仲葉預處理和溶液配制 稱取一定量干燥粉碎的杜仲葉，按料液比2∶5加入氯仿浸泡2次，每次4 h，抽濾自然風干備用。另取杜仲葉粗粉1.0g按本實驗最佳提取工藝提取綠原酸，過濾，定容至50 mL，即為樣品液。精密稱取綠原酸對照品10 mg，置15 mL具塞試管中，用50%甲醇溶解，定容即得對照品溶液。

1.2.2 最大吸收波長的確定【3】精密吸取50 μl對照品溶液點于條形層析紙上，用水-醋酸-正丁醇(5∶l∶4)混合后的上清液作展開劑，飽和3.5 h后，上行展開，展距為15 cm時取出，并置低溫、避光風干。然后在紫外光分析儀下以254 nm的波長觀察，可見在Rf值為0.70 cm處出現淡藍色斑點，剪下各熒光斑點，加入50%甲醇溶解定容至10 mL，超聲震蕩20 min。再在200～400 nm波長下進行UV掃描，此時可在327 nm處觀察到最大吸收峰，故選擇為測定波長。

1.2.3 標準曲線的繪制 分別精密吸取5、10、15、20、25、30 μl對照品溶液，按“1.2.2”項下操作，用甲醇作空白對照，在波長327 nm下測定吸光度(A)，以A為縱坐標、綠原酸濃度C為橫坐標，繪制標準曲線。得回歸方程為：A=0.0359C+0.0029(r=0.9990)，綠原酸0.5～3.0 mg·L-1范圍內與吸光度的線性關系良好。

1.2.4 加樣回收率試驗 在已知含量的杜仲葉粗粉中加入不同量的綠原酸對照品，按“1.2.2”項下操作同法測定吸光度，得綠原酸含量。其平均回收率為98.65%，RSD為1.88%，表明此法回收率較好。

1.2.5 不同提取工藝提取綠原酸對比 超聲提取法【4】：精確稱取杜仲葉干粉10g，用60%乙醇按料液比1∶8、pH=5，浸泡12 h，超聲提取2次，每次40 min，然后抽濾，濃縮濾液。實驗重復3次，檢測綠原酸平均得率為2.16%，RSD 0.09%。

水提取法【5】：精確稱取杜仲葉干粉10g，用雙蒸水按料液比1∶25、pH=5、溫度為65℃提取2次,每次90min，將濾液抽濾，濃縮。實驗重復3次，檢測綠原酸平均得率為1.57%，RSD 0.12%。

乙醇提取法【6】：精確稱取杜仲葉干粉10g，用70%乙醇按料液比1∶16在90℃水浴中回流提取2次，每次1.5 h，再抽濾并濃縮濾液。實驗重復3次，檢測綠原酸平均得率1.93%，RSD 0.05%。

微波提取法【7】：精確稱取杜仲葉干粉10g，在微波處理器中反復處理 3次，每次30S，再用超聲波提取30 min，接著抽濾，收集濾液。殘渣加400mL水重復提取1次，抽濾，濃縮濾液。實驗重復3次，檢測綠原酸平均得率為1.99%，RSD 1.03%。綜上可見四種提取工藝中超聲提取法綠原酸得率較高，且工藝穩(wěn)定，因此本實驗采用超聲提取法提取綠原酸。

1.2.6 單因素考察提取工藝 為觀察提取次數、乙醇濃度、料液比、超聲提取時間與溶劑pH等因素對綠原酸得率的影響，先稱取杜仲葉粗粉若干份，每份均為1.0g，進行下列實驗：

提取次數的影響：取杜仲葉粗粉5份，按料液比1∶16加入70%乙醇，在pH=5，常溫下超聲提取，5份樣本分別提取1、2、3、4、5次，每次40 min。測得的綠原酸得率分別為：1.87%，1.92%，1.92%，1.92%，1.92%。結果顯示提取2次后，綠原酸得率開始趨于平緩。多次提取綠原酸的得率提高不明顯，而工作量、生產成本提高，故實驗采用2次提取。

乙醇濃度的影響：取杜仲葉粗粉6份，按料液比1∶16加入濃度分別為20%、30%、40%、50%、60%、70%的乙醇，在pH=5，常溫下提取2次，每次40 min，經測定濾液綠原酸含量發(fā)現其提取率分別為1.92%、1.95%、1.97%、2.12%、1.99%、1.92%。

料液比的影響：取杜仲葉粗粉6份，按料液比l∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14與1∶16加入50%乙醇，在pH=5，常溫下提取2次，每次40min，過濾合并提取液，測定含量。綠原酸得率分別為1.97%、2.00%、2.02%、2.09%、2.10%、2.11%。

提取時間的影響：取杜仲葉粗粉6份，按料液比1∶12加入50%乙醇，在pH=5，常溫下提取，時間分別為10、20、30、40、50、60min，各提取2次，合并濾液。測得綠原酸的提取率分別為：1.90%，2.02%，2.06%，2.07%，2.07%，2.08%。

溶劑pH的影響：先用酸調節(jié)50%乙醇的pH,使之分別為2、3、4、5、6等6種溶劑，然后按料液比為1∶12加入相應的6份杜仲葉粗粉中，在常溫下提取2次，每次40 min，考察pH值對綠原酸得率的影響。測得綠原酸的提取率分別為：1.86%，2.08%，2.10%，2.13%，1.99%。結果顯示乙醇濃度、料液比、超聲提取時間、溶劑pH均對綠原酸提取有明顯影響。

1.2.7 正交試驗 選取超聲提取法，頻率為25kHz.根據單因素試驗結果，提取次數為2次，將影響綠原酸提取效果的幾個主要因素即提取時間(A)、乙醇體積分數(B)、料液比(C)、提取溶劑的pH值(D),進行正交設計，正交因素水平設計見表1。稱取杜仲葉粗粉9份，每份1.0g，按正交表L9(34)安排正交實驗,測定綠原酸的得率(見表2)。結果可見對提取因素影響大小順序為:C>A>B>D，最佳工藝條件為 A1B3C3D2。

表1 因素水平表

表2 正交實驗結果

1.2.8 最佳條件下的驗證實驗 稱取杜仲葉粗粉1.0g在最佳條件下進行了3批驗證試驗，綠原酸平均得率為2.54%，RSD 0.98%。

2 討論

本研究采用紙層析-UV分光光度法對綠原酸含量進行測定，可有效避免杜仲葉提取物中黃酮類物質對綠原酸的干擾而導致的測定結果偏差【8】。實驗發(fā)現同等工藝條件下，四種工藝提取綠原酸的得率均低于文獻報道。采用不同提取法杜仲葉中綠原酸得率的文獻報道值如下：超聲提取為2.61%【4】、水提為1.97%【5】、乙醇(70%)提取為4%以上【6】、微波強化提取為3.17%【7】。而我們采用上述文獻相應工藝提取綠原酸的得率分別為2.16%、1.57%、1.93%、1.99%，均低于相應文獻報道。究其原因可能與杜仲葉的產地、采收季節(jié)、采收時的樹齡、綠原酸含量測定方法等因素有關。貴州遵義是杜仲的主產地之一【9】，并且當地原料中綠原酸的含量較高【10】，目前尚且沒有成熟的提取工藝，為更合理利用這一寶貴資源，我們的研究目的在于優(yōu)化超聲提取杜仲葉中綠原酸的工藝。

考慮工業(yè)生產條件，本實驗未采用加熱方法，但超聲時間過長，溫度也會上升，會對綠原酸穩(wěn)定性產生影響，所以我們還觀察了超聲提取過程中溫度的變化。發(fā)現在10～60min內，超聲提取時溶液溫度僅在30～50℃變動，而綠原酸在此范圍內化學性質穩(wěn)定，故溫度變化對綠原酸提取無影響。超聲提取時不需加熱，避免了醇提取與水提取需加熱，以及微波瞬時高溫對有效成分的不良影響，同時也節(jié)省了能源；超聲提取還具有溶劑用量少，在提取過程中不發(fā)生化學反應，對綠原酸的生理活性無影響，有利于進一步分離純化和不污染環(huán)境等優(yōu)點。所以本實驗選用超聲提取工藝進行優(yōu)化，并根據文獻選擇25kHz的頻率。單因素考察提取工藝的結果表明，提取2次綠原酸得率較高，且節(jié)約工時和成本。另據單因素考察提取工藝結果，我們在乙醇體積分數、料液比、提取時間、溶劑的pH值等幾個因素中各選出3個相鄰的子因素進行考察。選擇的原則是，以3個連續(xù)子因素所對應的綠原酸得率最高或較高，并適當考慮節(jié)省人力與物力。通過正交設計實驗確定，超聲(25kHz)提取法的最佳工藝條件為：用60%乙醇為溶劑，料液比1∶12， pH=5，提取時間30 min，提取2次。最佳條件下的驗證實驗結果表明，該提取工藝比較穩(wěn)定,重現性良好。

【1】 Luo J,Tian C,Xu J,Sun Y.Studies on the antioxidant activity and phenolic compounds of enzyme-assisted water extracts from Du-zhong (Eucommia ulmoides Oliv.) leaves【J】.J Enzyme Inhib Med Chem,2009,24(6):1280-1287.

【2】 蘭小艷,張學俊,龔桂珍.杜仲葉中綠原酸的研究進展【J】.中國農學通報,2009,(21):86-89.

【3】 齊惠麗.杜仲葉中綠原酸提取工藝研究【D】.天津:天津大學,2007.

【4】 齊惠麗,趙廣榮,李東.杜仲葉中綠原酸的超聲提取工藝研究【J】.西北藥學雜志,2007,(6):300-301.

【5】 李光鋒.杜仲葉中綠原酸的提取、純化研究【D】.長沙:湖南農業(yè)大學,2006.

【6】 左航,黃文,李天宏,等.杜仲葉中綠原酸的提取條件優(yōu)化及其提取物的降血脂作用【J】.林業(yè)科學,2009,(1):158-160.

【7】 李劍敏,衛(wèi)兵兵,陳志紅.微波強化提取杜仲葉中綠原酸的工藝研究【J】.應用化工,2006,35(4):243-245.

【8】 胡鮮寶,范貴生,呂加平.綠原酸提取純化及檢測方法的研究進展【J】.農產品加工學刊,2009,(11):85-88.

【9】 李新貴,黃小柱,林皎.遵義縣杜仲采種基地營建技術及經營措施【J】.中南林業(yè)調查規(guī)劃,2009,28(2):27-30.

【10】 鄒小燕,李金華,葛發(fā)歡,等.高效液相色譜法測定不同產地杜仲葉的綠原酸含量【J】.中外醫(yī)療,2008,27(20):10-11.

StudyonextractiontechnologyofchlorogenicacidfromleavesofEucommiaulmoidesOlivinZunyi

Xiaoyuan,Liwenna,Huangxienan,Chenyang

(Zhuhai Campus of Zunyi Medical College,Guangdong Zhuhai 519041,China)

ObjectiveTo optimize the extraction parameters of chlorogenic acid from leaves ofEucommiaulmoidesOliv.MethodsThe efficiency of extraction parameters was evaluated by detecting the chlorogenic acid extraction rate and the extraction parameters were optimized by single factor and orthogonal experiments.ResultsUsing ultrasonic (25kHz) extraction technology,when the powder of leaves ofEucommiaulmoidesOliv.was treated with 60% ethanol at a herb to solution ratio of 1∶12 and pH 5 for 30 min,the highest extraction rate (2.54%) of chlorogenic acid was obtained.ConclusionThe optimal parameters of ultrasonic technology for chlorogenic acid extraction from the leaves ofEucommiaulmoidesOliv.are that 60% ethanol is used as solvent with the herb to solution ratio of 1∶12 and pH 5 for 30 min.

leaf ofEucommiaulmoidesOliv;chlorogenic acid;extraction technology

貴州省中醫(yī)藥管理局項目(NO：QZYY-2010-60)；遵義醫(yī)學院博士啟動基金項目(NO：F-127)。

李文娜，女，博士,副教授,研究方向：心血管藥理與新藥研發(fā)，E-mail:lielizabeth@126.com。

R28

A

1000-2715(2012)05-0383-03

【收稿2012-05-24；修回2012-09-11】

(編輯：譚秀榮)