葛根素磷脂復合物的制備及鑒別

孫燕 （山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學院 山東 濰坊 261021）

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葛根素磷脂復合物的制備及鑒別

孫燕 （山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學院 山東 濰坊 261021）

采用正交設計優(yōu)化復合物的制備工藝；用透射電鏡、紫外分析(UV)和紅外分析法(IR)對形成的復合物進行鑒別。結(jié)果表明：葛根素磷脂復合物的優(yōu)化制備條件為：在40℃下以無水乙醇為反應溶劑，葛根素與大豆磷脂的比例為1:2(m/m)，藥物反應濃度為10mg·ml-1，反應時間為1.5h；透射電鏡下觀察顯示：葛根素磷脂復合物的物理形態(tài)為類似脂質(zhì)體的橢圓形多層囊；UV結(jié)果顯示：大豆磷脂在400~200nm波長區(qū)無吸收峰，葛根素、葛根素磷脂復合物和葛根素磷脂混合物的紫外圖譜形狀相同，最大吸收峰均在250.2nm處，IR結(jié)果顯示：葛根素磷脂復合物的IR圖譜為葛根素與大豆磷脂不同光譜的加合。結(jié)論：葛根素磷脂復合物的形成受溶劑、反應物濃度和反應物投料比例的影響較大；磷脂復合物中葛根素和大豆磷脂的基本化學結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生根本的改變，未形成新的化合物，也不是混合物，而是一個磷脂復合物。

葛根素 磷脂復合物 鑒別

葛根素(Puerarin Pue)是常用中藥葛根(Pueraria Lobata Ohwi)的主要有效成分，是一種黃酮類化合物，具有擴張冠狀動脈和腦血管、降低心肌氧耗、改善心肌收縮功能、降低血液粘度、增加腦血流量等藥理作用[1-4]，由于葛根素結(jié)構(gòu)中的多苯環(huán)和多羥基的原因，其極性較大，水溶性較小(屬微溶于水的藥物)[5]脂溶性也小(難溶于氯仿)，難以被胃腸道等生物膜吸收，口服生物利用度小于15%[6,7]，從而限制了葛根素在臨床上的應用。據(jù)報道，天然活性成分與磷脂在一定條件下進行復合，得到天然活性成分磷脂復合物(phospholipid complex)，其理化性質(zhì)和生物特性較原化合物均有不同程度的改變，具有較強的親脂性，可有效地提高天然活性成分在體內(nèi)的吸收，顯著地改變其生物有效性[8,9]。本文制備葛根素磷脂復合物，并對其進行鑒別，有望提高葛根素口服的生物利用度。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 RH-D-KT/C磁力加熱攪拌器(德國IKA公司)，MA20型電子分析天平(上海第二天平儀器廠)，ZFQ-85A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海醫(yī)械專機廠)，SHB-B循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城儀器廠)，H.H.S 11.2電熱恒溫水浴鍋(上海醫(yī)療器械三廠)，ZK-82A型真空干燥箱(上海市實驗儀器總廠)，H-7500透射電子顯微鏡(日本日立公司)，UV-2501PC紫外分光光度計(日本島津株式會社生產(chǎn))，F(xiàn)T/IR-460型傅立葉變換紅外光譜儀(JASCO 日本分光公司)。

1.1.2 藥品與試劑 葛根素原料(山東醫(yī)院科學院藥物研究所提供)，大豆磷脂(濰坊醫(yī)學院藥理教研室提供)，甲醇、乙酸乙酯、無水乙醇、氯仿、丙酮、四氫呋喃等均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 葛根素磷脂復合物的制備 利用葛根素不溶于氯仿，而磷脂和葛根素磷脂復合物均易溶于氯仿的特性，將一定量的葛根素和磷脂在一定條件下反應后，減壓除去反應溶劑，再加適量的氯仿，充分溶解其中的磷脂及復合物，除去上清液，再用少量氯仿洗滌，收集沉淀，干燥并稱重，葛根素的初始投藥量與沉淀量的差值即為與磷脂復合的葛根素的量，從而計算出葛根素與磷脂的結(jié)合百分率，計算公式如下：葛根素與磷脂的結(jié)合率(%)=(AI-AD)/AD×100%，其中，AI為葛根素的初始投藥量；AD為沉淀量。

1.2.2 葛根素磷脂復合物的鑒別 取少量葛根素磷脂復合物粉末，加適量的蒸餾水分散后，用銅網(wǎng)沾取樣品溶液，經(jīng)1%磷鎢酸染液染色后在透射電子顯微鏡下觀察并拍照。可見葛根素磷脂復合物的物理形態(tài)為圓形或橢圓形，包膜完整。

2 結(jié)果

2.1 反應溶劑

設定葛根素與大豆磷脂的投料比為1:3(m/m)，反應溫度為40℃，反應時間為1.5h，葛根素濃度為20mg·ml-1，以葛根素與磷脂的結(jié)合百分率為評估標準，對甲醇、乙醇、四氫呋喃、乙酸乙酯、氯仿和丙酮進行考察，優(yōu)選出最佳反應溶劑，結(jié)果見表1。

表1 反應溶劑對結(jié)合率的影響 (%)

由表1可以看到，以甲醇和乙醇為反應溶劑時，藥物的結(jié)合率均超過50%，且兩者相比，前者的結(jié)合率更高，反應更完全，理應為最佳溶劑，但甲醇毒性較大，綜合考慮選乙醇為反應溶劑。

2.2 反應時間

反應溶劑為無水乙醇，分別考察反應時間為0.5、1.0、1.5、2.0、3.0h藥物的結(jié)合百分率，結(jié)果見表2。

表2 反應時間對結(jié)合率的影響 (%)

由表2可以看出，藥物與大豆磷脂的反應于1.5h后基本完全，受時間影響較小。

2.3 反應溫度

考察不同溫度下葛根素與磷脂的結(jié)合率，結(jié)果見表3。

表3 溫度對藥物復合率的影響 (%)

由表3可以看出，隨著溫度的升高，藥物的結(jié)合率略呈上升趨勢。

2.4 反應物濃度

反應物濃度(葛根素計)藥物結(jié)合率的影響，結(jié)果見表4。

表4 反應物濃度對藥物結(jié)合率的影響 (%)

由表4可以看出，反應物的濃度對復合率有較大影響，在其他條件相同的情況下，隨藥物濃度的增加，藥物的結(jié)合率逐漸降低。

2.5 葛根素與磷脂的投料比例

考察葛根素與大豆磷脂的投料比不同時的藥物反應百分率，結(jié)果見表5。

表5 葛根素與磷脂的投料比對藥物結(jié)合率的影響 (%)

由表5可以看出，藥物的結(jié)合率隨葛根素在體系中所占比例的降低而增加，葛根素與磷脂的投料比對藥物的結(jié)合率有較大影響。

2.6 葛根素大豆磷脂復合物反應條件的優(yōu)化

以藥物與磷脂的投料比例(A)、反應溫度(B)及反應物的濃度(C)這3個影響因素的3個水平進行正交設計，采用L9(34)表，結(jié)果見表6。對測定結(jié)果進行方差分析，見表7。

表6 正交設計試驗結(jié)果 (%)

注：n=3

表7 正交設計數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析結(jié)果

注：F0.01(2，2)=99，F(xiàn)0.05(2，2)=19

根據(jù)表7方差分析的結(jié)果，由A因素顯著且PA1PC2>PC3，擇C較低的水平，即較小的反應濃度；B因素不顯著而選擇反應于40℃下進行。結(jié)合實際條件權(quán)衡后，選擇藥物與大豆磷脂的比例為1:2(m/m)，藥物反應濃度為10mg·ml-1，反應溫度為40℃下進行的較優(yōu)反應條件，經(jīng)試驗驗證其藥物結(jié)合率約為88%，為淺黃色略粘的粉末。

2.7 葛根素磷脂復合物的紫外光譜(UV)分析

將大豆磷脂、葛根素、葛根素磷脂混合物、葛根素磷脂復合物分別溶于無水乙醇中，在200~400nm進行紫外掃描，結(jié)果顯示大豆磷脂在200~400nm波長區(qū)無吸收峰，葛根素、葛根素磷脂混合物和葛根素磷脂復合物的UV圖譜形狀相同，最大吸收峰均在250.2nm處，UV光譜分析表明磷脂復合物中葛根素的發(fā)色團的結(jié)構(gòu)未發(fā)生改變。

2.8 葛根素磷脂復合物的紅外光譜(IR)分析

分別取葛根素、大豆磷脂、葛根素磷脂復合物及葛根素與磷脂的物理混合物少許，采用溴化鉀壓片法制樣，于400~4000cm-1進行紅外光譜測定。可以看出，大豆磷脂的IR光譜與葛根素的IR光譜是完全不同的。大豆磷脂與葛根素混合物的IR光譜基本上呈現(xiàn)葛根素的IR圖譜特征，但是大豆磷脂IR圖譜的幾個吸收峰如1733cm-11456cm-1和吸收峰仍能找到，不過這些吸收峰與葛根素的吸收峰靠得很近，其峰體的大部分以相互重疊，故峰體變寬，但在近峰頂部分裂成各自的吸收峰，且峰波數(shù)均保持不變。大豆磷脂的另兩個1229cm-1和1056cm-1的吸收峰則被葛根素較寬的1257cm-1吸收峰和1118、1081、1040及1000cm-1組吸收峰完全掩蓋，葛根素與大豆磷脂混合物的IR圖譜為葛根素和大豆磷脂兩個成分IR加合。葛根素磷脂復合物的IR圖譜與混合物的IR圖譜完全不一樣，不再保持葛根素IR圖譜的基本特征。葛根素的1632cm-1和1257cm-1吸收峰形狀和寬度發(fā)生了一定的變化，說明葛根素結(jié)構(gòu)中的官能團與大豆磷脂分子的某些部分發(fā)生了相互作用。磷脂復合物的IR圖譜中所保留的大豆磷脂的2923cm-1和1056cm-1吸收峰形狀和寬度也發(fā)生了一定的變化，這說明大豆磷脂的結(jié)構(gòu)受到葛根素的影響。IR光譜分析結(jié)果表明磷脂復合物中葛根素與大豆磷脂基本化學結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生根本的改變，未形成新的化合物，也不是混合物，而是一個磷脂復合物。

3 討論

（1）本研究以葛根素和磷脂復合的百分率作為評價指標，采用單因素影響實驗和正交設計實驗優(yōu)化了葛根素磷脂復合物的制備工藝，按得到的優(yōu)化條件制備的磷脂復合物的結(jié)合率為80%以上。經(jīng)過工藝篩選，選擇價格低、來源方便、低毒的乙醇為反應溶劑，得到了88%的結(jié)合率，這與文獻[10]報道的以介電常數(shù)大的甲醇和乙醇為反應溶劑時，由于介電常數(shù)大所產(chǎn)生的反向電勢也大，從而降低了反應物間的相互作用力，不利于異號離子間化合反應的結(jié)論不相一致。提示對葛根素磷脂復合物的相關(guān)劑型的有待進一步研究。（2）采用透射電鏡觀察到磷脂復合物的形態(tài)呈圓形或橢圓形，類似脂質(zhì)體。但由于兩者的生成機制截然不同，因而其內(nèi)部結(jié)構(gòu)必定存在差異。脂質(zhì)體是將藥物包裹在由磷脂形成的封閉的囊泡內(nèi)，藥物游離于囊泡內(nèi)的溶液中，或分散在磷脂的多層膜之間；而磷脂復合物則是藥物通過與磷脂的極性端之間的相互作用而與磷脂結(jié)合在一起，這并不影響磷脂的兩性作用及其在水中分散的特性，當其攜帶藥物分子在水中分散時，分子間有序排列形成外觀類似脂質(zhì)體的多層囊。（3）本研究采用UV光譜分析結(jié)果顯示，葛根素、葛根素磷脂混合物、葛根素磷脂復合物的UV圖譜形狀相同，最大吸收峰均在250.2nm處，表明磷脂復合物種葛根素的發(fā)色團的結(jié)構(gòu)未發(fā)生改變，即磷脂復合物中葛根素的化學結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生根本的變化，沒有新物質(zhì)的生成。（4）IR光譜分析結(jié)果顯示，葛根素磷脂復合物的圖譜較葛根素及物理混合物的圖譜發(fā)生了明顯的變化，這種變化證明了葛根素磷脂復合物是葛根素分子與磷脂的極性端之間發(fā)生了相互作用而產(chǎn)生的結(jié)果，而不是簡單的物理混合。

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（2012–06–14）

S853.72

A

1007-1733(2012)10-0005-03