栗 新，胡祖余，王舉勇，占松鶴

(1.安徽省六安市裕安區(qū)動(dòng)物疫情測報(bào)站，安徽六安 237000;2.安徽省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心，合肥 230000)

重組禽流感病毒H5亞型二價(jià)滅活疫苗(H5N1，Re-4+Re-5)是用于預(yù)防由H5亞型禽流感病毒引起的禽流感，在我國受變異毒株威脅區(qū)的種雞、蛋雞使用普遍[1]，水禽免疫也有記載[2-3]，但在預(yù)防肉鴿禽流感方面未見報(bào)道。為了解該種禽流感疫苗不同劑量對肉鴿的免疫效果以及探討免疫程序，從而指導(dǎo)肉鴿養(yǎng)殖場合理使用禽流感疫苗，本研究開展了免疫肉鴿效果試驗(yàn)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 禽流感疫苗 重組禽流感H5亞型二價(jià)滅活疫苗 (H5N1，Re-4+Re-5)批號(hào)為011161，由肇慶大華農(nóng)生物藥品有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 試驗(yàn)動(dòng)物為人工飼養(yǎng)的美國王鴿，從安徽省裕安區(qū)選取2個(gè)規(guī)模飼養(yǎng)場(Ⅰ場、Ⅱ場)開展試驗(yàn)。Ⅰ場存欄肉鴿4660只，其中1月齡以上肉鴿3700只;Ⅱ場存欄肉鴿5720只，其中1月齡以上肉鴿4250只。所有試驗(yàn)鴿均未接種過禽流感疫苗。

1.3 診斷試劑 H5(Re-4)診斷抗原(批號(hào)201101)和陽性血清(批號(hào)201101)、H5(Re-5)診斷抗原(批號(hào)201102)和陽性血清(批號(hào)201003)，均購于哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司。

2 試驗(yàn)方法

2.1 試驗(yàn)前準(zhǔn)備 接種疫苗前一周內(nèi)，對實(shí)驗(yàn)場地環(huán)境進(jìn)行消毒。同時(shí)采集肉鴿肛拭子10份，進(jìn)行H5亞型病原學(xué)檢測，采集40份血樣進(jìn)行禽流感H5(Re-4)、H5(Re-5)亞型抗體檢測。

2.2 試驗(yàn)分組 每場隨機(jī)選擇1月齡以上肉鴿320只，均分8個(gè)組，進(jìn)行隔離試驗(yàn)，其中7個(gè)組分別注射 0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、1.5、2.0 mL 試驗(yàn)疫苗，另外1組作空白試驗(yàn)對照。

2.3 免疫接種 使用連續(xù)注射器，采用胸部肌肉注射方法接種疫苗，并給試驗(yàn)肉鴿打上腳環(huán)，做好記錄。

2.4 二次免疫 選擇注射0.2、0.3、0.4、0.5 mL疫苗試驗(yàn)組肉鴿，在第一次免疫后第3周，將已免肉鴿半數(shù)進(jìn)行第二次免疫，免疫劑量、疫苗類型與首次免疫一致。1.0、1.5、2.0 mL試驗(yàn)疫苗組不進(jìn)行第二次免疫。

2.5 樣品采集 第一次免疫后2周開始采血，以后每周采血一次，每次每組隨機(jī)采血5份，連續(xù)采血8周。每只鴿翅膀下靜脈采血2 mL，分離血清，冷凍保存?zhèn)錂z。

2.6 抗體監(jiān)測 按《中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)——高致病性禽流感診斷技術(shù)》(GB/T18936-2003)規(guī)定的操作規(guī)范進(jìn)行血凝和血凝抑制試驗(yàn)，檢測H5亞型(Re-4、Re-5)禽流感抗體效價(jià)，判定檢測結(jié)果，每組求取抗體效價(jià)平均值，繪制折線圖[4]。

3 結(jié)果與分析

3.1 免疫前抗體檢測 H5亞型病原學(xué)檢測陰性(委托安徽省動(dòng)物疫控中心實(shí)驗(yàn)室檢測)，H5亞型(Re-4)、(Re-5)抗體檢測為陰性，空白對照組抗體檢測一直呈陰性。

3.2 不同劑量禽流感疫苗初次免疫抗體消長規(guī)律

H5(Re-4)抗體:由圖1可見，注射劑量大，抗體產(chǎn)生滴度高、峰值早、維持時(shí)間長、下降幅度小。0.2、0.3 mL組免后3周達(dá)有效保護(hù)水平，第5周達(dá)到峰值，能維持5余周;0.4、0.5 mL組免后第2周達(dá)有效保護(hù)水平，第4～5周達(dá)到峰值，能維持7余周;1.0、1.5、2.0 mL 組免后第2周達(dá)8 ～9 log2，第4周達(dá)到峰值，第9周下降到6.5 log2。

圖1 禽流感二價(jià)苗免疫一次肉鴿(Re-4)抗體變化水平

H5(Re-5)抗體:由圖2可見，注射劑量大，抗體產(chǎn)生滴度高、維持時(shí)間長、下降幅度小。0.2、0.3 mL組免后第3周達(dá)有效保護(hù)水平，第4周達(dá)到峰值，只能維持3～4周;0.4、0.5 mL組免后第2周達(dá)到有效保護(hù)水平，第4～5周達(dá)到峰值，能維持7余周;1.0、1.5、2.0 mL組免后第2周達(dá)6 log2以上，第4周達(dá)到峰值，第9周下降到6 log2左右。

圖2 禽流感二價(jià)苗初次免疫肉鴿(Re-5)抗體變化水平

3.3 不同劑量禽流感疫苗第二次免疫抗體消長規(guī)律 H5(Re-4)抗體:由圖3可見，H5第二次免疫后第1周，各組Re-4抗體測定值在6.5～9.5 log2之間，第2周達(dá)到峰值7～10 log2，整體高于同期初次免疫，且抗體水平曲線上下起伏不大，預(yù)計(jì)經(jīng)過二次免疫肉鴿，到初次免疫后第12周，抗體滴度仍能達(dá)到保護(hù)水平。

H5第二次免疫Re-5抗體:由圖4可見，H5第二次免疫后第1周，各組Re-5抗體測定值在7～8 log2之間，第2周達(dá)到峰值7.2～9.3 log2，整體高于同期初次免疫，且抗體水平曲線上下起伏不大，預(yù)計(jì)經(jīng)過二次免疫肉鴿，到初次免疫后第12周，抗體滴度也能達(dá)到保護(hù)水平。

圖3 禽流感二價(jià)苗第二次免疫肉鴿(Re-4)抗體變化水平

圖4 禽流感二價(jià)苗第二次免疫肉鴿(Re-5)抗體變化水平

4 小結(jié)

本試驗(yàn)證實(shí)了H5(Re-4+Re-5)亞型禽流感滅活疫苗免疫肉鴿的有效性，初次免疫的Re-4比Re-5抗體形成效果好，相對高出1個(gè)抗體滴度，且二者都是注射劑量大，抗體產(chǎn)生滴度高、維持時(shí)間長、下降幅度小。第二次免疫效果二者相近，都比初次免疫整體效果好，0.2、0.3 mL低劑量接種組初次免疫抗體形成效果不太理想，但加強(qiáng)免疫后抗體水平迅速上升，第二次免疫后2周達(dá)到峰值，而且下降緩慢，預(yù)計(jì)到初次免疫后第12周，抗體滴度也能達(dá)到保護(hù)水平。

最佳免疫劑量:選免一次，H5(Re-4)和H5(Re-5)都是至少注射疫苗0.4 mL;選免二次，H5(Re-4)、H5(Re-5)同劑量第二次免疫至少注射疫苗0.3 mL。

推薦免疫程序:鑒于肉鴿生性敏感，應(yīng)激反應(yīng)強(qiáng)，但天生免疫能力就好等生物學(xué)習(xí)性[5]，結(jié)合本試驗(yàn)數(shù)據(jù)，對1月齡內(nèi)出欄的商品肉鴿可不免或選免一次，1～2周齡每只接種0.4 mL。對1～6月齡青年肉鴿，可選免二次，一種是1～2周齡首免，4周齡進(jìn)行第二次免疫;另一種是4周齡首免，6周齡進(jìn)行第二次免疫，每只每次都是接種0.3 mL。對選育的種鴿，在6月齡開產(chǎn)前2周進(jìn)行三免，每只接種0.3 mL，以后相同劑量每半年免疫一次[6-7]。

[1]農(nóng)業(yè)部農(nóng)醫(yī)發(fā)〔2012〕1號(hào).2012年國家動(dòng)物疫病強(qiáng)制免疫計(jì)劃[S].

[2]陳桂英.鴨免疫重組禽流感病毒H5亞型二價(jià)滅活苗(H5N1，Re-5+Re-4)后抗體水平分析[J].中國獸醫(yī)雜志，2011，47(7):27-28.

[3]陳永忠，李俊平，李啟紅，等.重組禽流感病毒H5亞型二價(jià)滅活疫苗(H5N1，Re-5+Re-4)免疫雞和鴨后抗體消長規(guī)律[J].中國獸醫(yī)雜志，2010，46(5):20-21.

[4]GB/T18936-2003，高致病性禽流感診斷技術(shù)[S].

[5]李綬章.肉鴿鵪鶉飼料科學(xué)配制與應(yīng)用[M].北京:金盾出版社，2008:17-18.

[6]陳坤永，翁良樹，張祥解，等.種鴿免疫禽流感疫苗HI抗體水平消長規(guī)律的調(diào)研[J].養(yǎng)禽與禽病防治，2004，(7):12-13.

[7]周錦萍，劉佩紅，劉康明，等.重組H5N1亞型禽流感滅活苗對鴿免疫程序的初步研究「J」.中國獸醫(yī)雜志，2008，44(7):38-3009.