纖維素酶高產(chǎn)菌株誘變選育及固體發(fā)酵研究

何海燕，張健，覃擁靈，*

（1.河池學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系，廣西 宜州 546300；2.廣西衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530021）

植物纖維素是地球上最豐富、最廉價(jià)的可再生資源，占植物界碳素50%以上。植物每年通過光合作用，能產(chǎn)生高達(dá)15.5×1010t纖維素類物質(zhì)，其中纖維素、半纖維素的總量為8.5×1010t。纖維素組成葉干重的大約10%，木材的大于50%，麻纖維的70%～80%，棉纖維的90%～98%[1-2]。纖維素可以作為食品、飼料、能源、造紙、紡織、醫(yī)藥、建筑、電工、電子、機(jī)械等許多領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用[3-6]。

纖維素酶系是一組協(xié)同作用降解纖維素生成葡萄糖的酶的總稱，主要分為三類：葡聚糖外切酶（EC 3.2.1.91）在天然纖維素的降解過程主導(dǎo)作用，從纖維素鏈的末端水解β-1，4糖苷鍵，依次切下纖維二糖分子，生成纖維寡聚糖和纖維二糖；β-葡聚糖內(nèi)切酶（EC 3.2.1.4）可結(jié)合在纖維素鏈內(nèi)部的非結(jié)晶區(qū)的任何部位隨機(jī)水解β-1，4糖苷鍵，切斷纖維素鏈產(chǎn)生有非還原端的小分子纖維素，主要產(chǎn)物是纖維二糖、纖維三糖和纖維寡聚糖等；β-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.21）將纖維二糖或其他可溶性的纖維寡糖水解成葡萄糖分子，消除纖維二糖和纖維寡糖對葡聚糖內(nèi)切酶和葡聚糖外切葡酶的反饋抑制作用，在纖維素的降解中起著非常關(guān)鍵的作用[7]，纖維素酶在糧食、飼料、輕工業(yè)、能源等方面有廣泛運(yùn)用[8-9]。

本課題前期實(shí)驗(yàn)篩選得到一株高產(chǎn)纖維素酶的灰白青霉HML0233[10]，本實(shí)驗(yàn)對灰白青霉HML0233進(jìn)行誘變改良選育及固體發(fā)酵產(chǎn)酶研究，以期提高其酶活，為工業(yè)化應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)工藝參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌種

灰白青霉HML0233是實(shí)驗(yàn)室篩選保存菌種[10]。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 PDA斜面培養(yǎng)基[11]

1.2.2 固體發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基

3g蔗渣，2g麩皮。固體培養(yǎng)基材料均粉碎至100標(biāo)準(zhǔn)目數(shù)（篩孔尺寸0.15 mm），加入10 mL Mandels營養(yǎng)鹽液，250 mL錐形瓶，121℃滅菌20 min。

Mandels營養(yǎng)鹽液[12]：（NH4）2SO41.4 g，KH2PO42 g，CaCl20.3 g，MgSO4·7H2O 3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 5 mg，MnSO41.6 mg，CoCl22.0 mg，ZnCl21.7 mg，自然 pH，定溶于1000 mL蒸餾水中。

種子培養(yǎng)基：0.5%葡萄糖，Mandels營養(yǎng)鹽液。

1.3 紫外誘變灰白青霉HML0233

1.3.1 灰白青霉HML0233生長曲線的測定

灰白青霉HML0233斜面種30℃培養(yǎng)4 d復(fù)壯，取復(fù)壯后菌種接種200 mL種子培養(yǎng)基中，于30℃、160r/min搖床培養(yǎng)，每隔4h取樣，分光光度計(jì)在600nm下測定光密度，以未接種的培養(yǎng)基作對照。以培養(yǎng)不同時(shí)間的種子培養(yǎng)基的光密度為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)作圖，得到灰白青霉HML0233在種子培養(yǎng)基上的生長曲線[11]。

1.3.2 紫外誘變與與正突變菌種篩選

先將出發(fā)菌株接種于種子培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)，到達(dá)對數(shù)生長期后離心收集菌體，用無菌生理鹽水洗滌兩次，加入無菌生理鹽水使孢子數(shù)目達(dá)107數(shù)量級，振蕩成為單細(xì)胞懸液。

紫外誘變照射時(shí)間分別為0～100 s，時(shí)間梯度間隔10 s。以未經(jīng)紫外線照射處理的菌懸液涂布PDA平板，避光培養(yǎng)72 h，作為對照組計(jì)算致死率，以UV的照射時(shí)間為橫坐標(biāo)，致死率為縱坐標(biāo)，作致死率曲線[11]。

誘變突變株篩選：以致死率達(dá)90%以上的照射時(shí)間為誘變劑量處理菌懸液并涂布葡聚糖內(nèi)切酶活性鑒定平板：羧甲基纖維素鈉（CMCNa，F(xiàn)luka公司）10 g，瓊脂20 g，用Mandels營養(yǎng)鹽液定容至1000 mL，用高壓滅菌鍋121℃滅菌20 min后倒平板。把誘變后菌種涂布于葡聚糖內(nèi)切酶活性鑒定平板，30℃避光培養(yǎng)4 d，印章法轉(zhuǎn)移菌種至同規(guī)格PDA培養(yǎng)基中保存菌種，葡聚糖內(nèi)切酶活性鑒定平板用0.2%剛果紅染色20 min，1 mol/L的NaCl脫色，如可分泌葡聚糖內(nèi)切酶可以水解鑒定平板的CMCNa得到透明圈[13]。

從篩選平板上選取透明圈較大的菌落取菌種一環(huán)接種至種子液培養(yǎng)基，30℃，160 r/min培養(yǎng)24 h，使孢子預(yù)萌發(fā)，取107個(gè)孢子（1 mL）種子液接入固體培養(yǎng)基，30℃，培養(yǎng)4 d后測酶活復(fù)篩鑒定。

1.3.3 遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將篩選到的菌株接種于PDA培養(yǎng)基上傳代，參照1.3.2固體發(fā)酵方法，每代都在相同的發(fā)酵培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，共傳8代，測定其FPA酶活。

1.4 濾紙酶活測定（Filter paper assay，F(xiàn)Pase）

濾紙酶活（FPA）參照Mandels等的方法測定[12]：將1條whatman一號濾紙條[（1×6 cm；（50±1）mg]折疊放入試管底部，加1 mL pH 4.8的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液和0.05 mL適當(dāng)濃度的酶液混勻，30℃反應(yīng)60 min；對照管為沸水浴6 min滅活的粗酶液。然后用DNS法測定還原糖的生成量，比對葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算反應(yīng)產(chǎn)生的葡萄糖濃度確認(rèn)酶活。

酶活力單位定義：每秒催化產(chǎn)生1 mol還原糖需要的酶量為1 kat。

1.5 固體發(fā)酵產(chǎn)酶條件研究

1.5.1 發(fā)酵時(shí)間對固體發(fā)酵產(chǎn)酶影響及酶液的提取

取107個(gè)孢子轉(zhuǎn)入固體發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)，培養(yǎng) 3 d～6 d 后提取酶液。按 10∶1（mL/g 固體培養(yǎng)基）加入dd H2O，40℃，200 r/min恒溫?fù)u床2 h，八層紗布過濾，4℃，5000 r/min離心20 min，上清液即為粗酶液。

1.5.2 不同溫度、培養(yǎng)基初始pH、不同氮源對產(chǎn)酶的影響研究

接入107個(gè)孢子，30℃～50℃，每隔5℃一個(gè)梯度，培養(yǎng)適宜時(shí)間后提取酶液；調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH為4～7，考查培養(yǎng)基初始pH對產(chǎn)纖維素酶的影響；選擇不同氮源：蛋白胨、NH4Cl、NH4NO3、黃豆餅粉取代Mandels營養(yǎng)鹽液的（NH4）2SO4，考查不同氮源對誘變菌種產(chǎn)酶的影響。

酶液4℃冰箱中保存，待測酶活時(shí)用。三次平行實(shí)驗(yàn)，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外誘變灰白青霉HML0233

2.1.1 灰白青霉HML0233在種子培養(yǎng)基上的生長曲線

測定灰白青霉HML0233在種子培養(yǎng)基里面的生長情況，所得結(jié)果如圖1所示。

圖1 灰白青霉HML0233的生長曲線Fig.1 The growth curve of Penicillium canescens HML0233

0～36 h為生長延遲期，從40 h開始進(jìn)入對數(shù)生長期，菌體細(xì)胞數(shù)快速增長，細(xì)胞健壯；到48 h～60 h以后進(jìn)入繁殖率與死亡率逐漸趨向于平衡的穩(wěn)定期。本試驗(yàn)選擇對數(shù)生長中后期（48 h～56 h）的菌體進(jìn)行誘變選育，因?yàn)檫@時(shí)細(xì)胞活力最強(qiáng)，誘變效果較好。

2.1.2 紫外誘變致死率曲線

隨著紫外照射時(shí)間的延長，致死率逐漸增大，時(shí)間為60 s時(shí)，致死率為93%。當(dāng)時(shí)間達(dá)到80 s時(shí)致死率為100%，如圖2所示。

圖2 紫外誘變致死曲線Fig.2 The curves of death rate and survival rate after UV mutant

本實(shí)驗(yàn)選擇60 s的照射時(shí)間進(jìn)行紫外誘變。

2.1.3 紫外誘變結(jié)果

以 FPA酶活為 0.88×10-7kat/mL的灰白青霉HML0233為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外誘變得到15株突變菌株，編號為HBQ1-HBQ15，間隔接種于葡聚糖內(nèi)切酶活性鑒定平板，30℃培養(yǎng)3 d，經(jīng)剛果紅染色和NaCl脫色后[13]，葡聚糖內(nèi)切酶可以水解鑒定平板的CMCNa得到透明圈見圖3。

圖3 突變菌種在羧甲基纖維素鈉篩選平板上產(chǎn)生透明水解圈Fig.3 Mutant strains produced clear hydrolytic zone around theirs colonies on a CMCNa selective agar plate

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：透明圈直徑：菌體直徑數(shù)值越大，活力越高，其中HBQ14菌株酶活提高到1.46×10-7kat/mL，提高了66.6%，說明紫外誘變后HBQ14產(chǎn)纖維素酶活有明顯提高。利用羧甲基纖維素鈉為底物，剛果紅染色篩選產(chǎn)纖維素酶菌種，靈敏度高，產(chǎn)生的透明圈清晰，實(shí)驗(yàn)證明酶活與透明圈直徑：菌體直徑成線性關(guān)系，剛果紅透明圈篩選法可以快速篩選出產(chǎn)纖維素酶的菌株。以HBQ14菌株作為實(shí)驗(yàn)菌株，進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。

2.2 紫外誘變遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

誘變正突變HBQ14菌株的酶活為1.46×10-7kat/mL，8次傳代后酶活為1.42×10-7kat/mL，為母代菌株酶活的97.2%，代間酶活差異不大，證明HBQ14經(jīng)紫外誘變后遺傳性狀穩(wěn)定見表1。

表1 HBQ14菌株遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The inheritance stability experiments of the strain HBQ14

2.3 溫度對產(chǎn)纖維素酶的影響

較高的溫度可以提高發(fā)酵過程中微生物體內(nèi)生物化學(xué)反應(yīng)過程，提高催化合成纖維素酶的酶活性，結(jié)果見圖4。

圖4 溫度對產(chǎn)纖維素酶的影響Fig.4 The effect of temperature on activity of cellulose

當(dāng)培養(yǎng)溫度為40℃時(shí)，酶活比30℃培養(yǎng)溫度提高 22%，為 1.78×10-7kat/mL。

2.4 培養(yǎng)基初始pH

對產(chǎn)纖維素酶的影響40℃，不同pH培養(yǎng)4 d。設(shè)最適pH最高酶活為100%，測定不同pH相對酶活作圖，見圖5。

圖5 pH對產(chǎn)纖維素酶的影響Fig.5 The effect of pH on activity of cellulase

測定得出蔗渣天然固體培養(yǎng)基pH為6。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，pH為5.5時(shí)，HBQ14所產(chǎn)的纖維素酶酶活最高，比天然培養(yǎng)基提高12%，達(dá)到2.1×10-7kat/mL。培養(yǎng)基pH改變細(xì)胞膜所帶電荷，從而改變細(xì)胞膜的通透性，排出胞外纖維素酶增加，提高整體酶活。

2.5 氮源對產(chǎn)纖維素酶的影響

蛋白胨等5種氮源被用于固體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶，40℃，培養(yǎng)基初始 pH 為 5.5，培養(yǎng) 4 d。設(shè)（NH4）2SO4為氮源時(shí)酶活為100%，測定不同氮源相對酶活作圖，結(jié)果見圖6。

圖6 不同氮源對纖維素酶生產(chǎn)的影響Fig.6 The effect of nitrogen source on activity of cellulase

蛋白胨、黃豆餅粉等有機(jī)氮源產(chǎn)酶相對較低，NH4NO3可以明顯提高產(chǎn)酶能力，比（NH4）2SO4為氮源提高 16%，達(dá)到 2.35×10-7kat/mL。

3 小結(jié)

紫外線誘變育種是國內(nèi)外廣泛采用的提高菌種性能的育種方法，具有損傷輕、突變頻率高、突變譜寬、突變性狀穩(wěn)定等突出的優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用此方法可以選育到很多優(yōu)良突變株[14]?；野浊嗝笻ML0233經(jīng)過紫外誘變，經(jīng)過羧甲基纖維素鈉平板快速篩選得到一株P(guān)FA酶活達(dá)到1.46×10-7kat/mL的纖維素酶高產(chǎn)菌株HBQ14，經(jīng)過發(fā)酵條件初步優(yōu)化研究，以NH4NO3為氮源，40℃，pH 5.5培養(yǎng)4 d，PFA酶活達(dá)到2.35×10-7kat/mL，灰白青霉HBQ14遺傳性狀穩(wěn)定。課題計(jì)劃對灰白青霉HBQ14產(chǎn)纖維素酶發(fā)酵條件進(jìn)一步優(yōu)化，對纖維素原料進(jìn)行預(yù)處理，進(jìn)一步提高產(chǎn)酶量和水解纖維素糖化率，為應(yīng)用于纖維素酶的工業(yè)化生產(chǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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