王文佳，張正全，賈 欣，李雪冰，張振中

鄭州大學(xué)藥學(xué)院鄭州 450001

#通訊作者，女，1975年8月生，碩士，講師，研究方向:腫瘤靶向藥物治療，E-mail:jiaxin@zzu.edu.cn

2-甲氧基雌二醇對(duì)4T1、SPC-A1和PC-3細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用

王文佳，張正全，賈 欣#，李雪冰，張振中

鄭州大學(xué)藥學(xué)院鄭州 450001

#通訊作者，女，1975年8月生，碩士，講師，研究方向:腫瘤靶向藥物治療，E-mail:jiaxin@zzu.edu.cn

2-甲氧基雌二醇;維拉帕米;協(xié)同指數(shù);4T1;SPC-A1細(xì)胞;PC-3細(xì)胞

目的:探討2-甲氧基雌二醇(2-ME)對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。方法:以鼠乳癌4T1細(xì)胞株、人肺腺癌SPC-A1細(xì)胞株、人前列腺癌PC-3細(xì)胞株為研究對(duì)象，采用SRB法考察2-ME對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，并聯(lián)合維拉帕米，利用協(xié)同指數(shù)探討影響2-ME抗癌作用的因素。結(jié)果:2-ME對(duì)4T1、SPC-A1和PC-3細(xì)胞有不同程度的抑制作用，IC50分別是6.11、1.89和5.12 μmol/L;聯(lián)合維拉帕米后，抑制率高于單獨(dú)用藥組(P＜0.01)，IC50分別降低至2.01、0.57和2.77 μmol/L，協(xié)同指數(shù)0.77～0.43。結(jié)論:2-ME對(duì)3種細(xì)胞都有一定的生長(zhǎng)抑制作用，維拉帕米對(duì)2-ME有明顯的增效作用。

2-甲氧基雌二醇(2-methoxyestradiol，2-ME)具有阻滯細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及抑制血管新生的作用［1］，且由于其不良反應(yīng)小，極具研究?jī)r(jià)值。乳癌、前列腺癌的致病原因跟雌激素息息相關(guān)，作者以鼠乳癌4T1細(xì)胞株、人肺腺癌SPC-A1細(xì)胞株、人前列腺癌PC-3細(xì)胞株為研究對(duì)象，采用硫基羅丹明蛋白染料(SRB)法考察2-ME對(duì)3種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用，并聯(lián)合維拉帕米，利用協(xié)同指數(shù)探討影響2-ME抗癌作用的因素。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、藥品及主要試劑 3種細(xì)胞株由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫提供(目錄號(hào)分別是TCM32、TCHu53、TCHu158)。RPMI 1640、DMEM培養(yǎng)基(HyClone，北京賽默飛世爾生物化學(xué)有限公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，SRB和Tris堿(美國(guó)Sigma公司)，胰蛋白酶(吉諾生物生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司)。2-ME(自制，純度＞99.0%)。DMSO等其他試劑均為國(guó)產(chǎn)AR級(jí)試劑。

1.2 維拉帕米對(duì)3種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用4T1、SPC-A1和PC-3細(xì)胞以每孔5×103mL－1接種于96孔板上，在37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)液，加入含總質(zhì)量濃度為100、80、40、20、10、5 mg/L的維拉帕米培養(yǎng)液，每質(zhì)量濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔。以空白培養(yǎng)基為陰性對(duì)照，再入培養(yǎng)箱于相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)72 h，采用SRB法于570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度值(A值)，計(jì)算抑制率(%)=(1－A/A0)×100%。A:各藥物組吸收值，A0:未加藥物(對(duì)照組)吸收值。

1.3 2-ME對(duì)3種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用 同1.2的方法培養(yǎng)3種細(xì)胞，24 h后更換培養(yǎng)液，分別加入含濃度為0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、10.0 μmol/L的2-ME，每濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔。以空白培養(yǎng)基為陰性對(duì)照，后續(xù)實(shí)驗(yàn)同1.2。

1.4 增效作用研究 向1.3項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中2-ME作用的4T1、SPC-A1和PC-31細(xì)胞同時(shí)加入一定量的維拉帕米，其他方法同1.3項(xiàng)，維拉帕米的質(zhì)量濃度由1.2項(xiàng)確定。

1.5 各組細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察 倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)及形態(tài)變化特點(diǎn)。

1.6 協(xié)同指數(shù)(CI)計(jì)算 采用Chou-Talalay法，計(jì)算公式為:CI=D1/DX1+D2/DX2。DX1和DX2分別指兩藥單獨(dú)使用時(shí)細(xì)胞增殖抑制率達(dá)X%時(shí)的藥物濃度，D1和D2指兩藥聯(lián)合使用時(shí)細(xì)胞增殖抑制率達(dá)X%時(shí)各自的藥物濃度。CI＜1.0時(shí)表示協(xié)同作用，CI=1.0時(shí)表示相加作用，而CI＞1.0時(shí)則表示拮抗作用。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0進(jìn)行分析。應(yīng)用Probit法計(jì)算IC50值，并在此基礎(chǔ)上選用維拉帕米的質(zhì)量濃度。應(yīng)用析因設(shè)計(jì)的方差分析比較2-ME單用及與維拉帕米聯(lián)合對(duì)4T1、SPC-A1和PC-3細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 維拉帕米對(duì)3種腫瘤細(xì)胞的IC50維拉帕米對(duì) 4T1、SPC-A1和 PC-3細(xì)胞的 IC50值分別為(49.05±5.4)、(77.90±11.0)和(44.51±3.9) mg/L。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用聯(lián)合維拉帕米的質(zhì)量濃度為非細(xì)胞抑制劑量(10.3 mg/L)。

2.2 2-ME單用及與維拉帕米聯(lián)合對(duì)3種腫瘤細(xì)胞的IC50見表1。加入維拉帕米后，2-ME對(duì)3種細(xì)胞的IC50下降，增敏倍數(shù)分別是3.01、3.32和1.85。

表12 -ME單用及與維拉帕米聯(lián)合對(duì)3種細(xì)胞的IC50 μmol/L

2.32-ME單用及與維拉帕米聯(lián)合對(duì)4T1、SPC-A1和PC-3細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用 見表2～4。由表2～4可知，不同劑量的2-ME對(duì)3種細(xì)胞的抑制率不同，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，加入維拉帕米后，抑制率得到提高，且2-ME和維拉帕米有交互效應(yīng)。

2.5 形態(tài)學(xué)觀察 見圖1。倒置顯微鏡下可見空白對(duì)照組的3種細(xì)胞形態(tài)完整，呈現(xiàn)長(zhǎng)梭形或菱形，生長(zhǎng)密集，貼壁良好，相互連接成片，胞質(zhì)透亮。2-ME作用的細(xì)胞相互脫離，易浮起，細(xì)胞密度下降;且隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞間的連接斷裂、細(xì)胞間隙增大，部分細(xì)胞體積縮小，核染色質(zhì)和胞質(zhì)濃縮，死細(xì)胞增多。加入維拉帕米后，相同2-ME作用濃度下，死細(xì)胞增多，總體細(xì)胞數(shù)量明顯減少，劑量依賴性更加明顯。

表22 -ME單用及與維拉帕米聯(lián)合對(duì)4T1細(xì)胞的抑制率(n=4) %

表32 -ME單用及與維拉帕米聯(lián)合對(duì)SPC-A1細(xì)胞的抑制率(n=4) %

表42 -ME單用及與維拉帕米聯(lián)合對(duì)PC-3細(xì)胞的抑制率(n=4) %

圖12 -ME單用及與維拉帕米聯(lián)合對(duì)4T1、SPC-A1和PC-3細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響(×200)

2.6 2-ME聯(lián)合維拉帕米對(duì)3種細(xì)胞的CI 4T1、PC-3和 SPC-A1細(xì)胞的 CI分別是0.54、0.77和0.43，均＜1，說明有協(xié)同作用。

3 討論

雌激素與乳癌的發(fā)生密不可分，身體內(nèi)雌激素的水平過高會(huì)導(dǎo)致乳癌的發(fā)生［2］。前列腺的增長(zhǎng)和功能的維持依賴于恒定的足夠水平的雄激素，在人前列腺基質(zhì)中存在雌激素受體，通過改變受體表達(dá)水平和激活雌激素受體，參與良性前列腺增生及前列腺癌的發(fā)生［3］。

2-ME是雌激素的天然代謝產(chǎn)物，在體內(nèi)細(xì)胞中含量量極低。由2-ME對(duì)3種腫瘤細(xì)胞的IC50可知2-ME對(duì)SPC-A1細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)，其次是PC3和4T1細(xì)胞。分析原因，乳癌和前列腺癌在雌激素的長(zhǎng)期刺激下，有可能對(duì)和雌激素結(jié)構(gòu)類似的2-ME敏感度下降，療效降低，導(dǎo)致2-ME對(duì)其的抑制作用不如對(duì)和雌激素關(guān)系欠密切的SPC-A1細(xì)胞的強(qiáng)。

有研究［4］表明，癌細(xì)胞對(duì)某一抗癌藥敏感性低或發(fā)生耐藥性時(shí)，其機(jī)制大多為抗癌藥在細(xì)胞內(nèi)的蓄積濃度下降，維持時(shí)間縮短。最近研究［5］認(rèn)為P-糖蛋白(P-gp)是鈣通道的一部分，可被維拉帕米等鈣拮抗劑所抑制，減少抗癌藥的外流，提高其在細(xì)胞內(nèi)的蓄積濃度，從而增強(qiáng)了藥物的抗癌活性。為了證明這一影響因素，作者在2-ME作用于癌細(xì)胞的同時(shí)加入維拉帕米，考察維拉帕米對(duì)2-ME的抗腫瘤增效作用。結(jié)果顯示加入維拉帕米后2-ME對(duì)4T1、SPC-A1和PC-3細(xì)胞的IC50均有所下降，協(xié)同效應(yīng)結(jié)果也提示維拉帕米可增加2-ME的抗腫瘤效果。

總之，該實(shí)驗(yàn)在體外證實(shí)鈣拮抗劑維拉帕米能增強(qiáng)2-ME對(duì)腫瘤細(xì)胞的抗癌活性，該結(jié)果為2-ME與鈣拮抗劑合用治療癌癥的思路提供了一定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。

［1］ Agoston GE，Shah JH，Lavallee TM，et al.Synthesis and structure-activity relationships of 16-modified analogs of 2-methoxyestradiol［J］.Bioorg Med Chem，2007，15(24): 7524

［2］楊契，韓為東，趙亞力.乳腺癌與雌激素及有關(guān)內(nèi)分泌治療［J］.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2007，15(5):729

［3］Zhou D，Li S，Wang X，et al.Estrogen receptor alpha is essential for the proliferation of prostatic smooth muscle cells stimulated by 17β-estradiol and insulin-like growth factor 1［J］.Cell Biochem Funct，2011，29(2):120

［4］Lewinson O，Lee AT，Locher KP，et al.A distinct mechanism for the ABC transporter BtuCD-BtuF revealed by the dynamics of complex formation［J］.Nat Struct Mol Biol，2010，17(3):332

［5］Du Y，Shi WW，He YX，et al.Structures of the substratebinding protein provide insights into the multiple compatible solutes binding specificities of Bacillus subtilis ABC transporter OpuC［J］.Biocherm J，2011，436(2):283

Growth inhibition effects of 2-methoxyestradiol on 4T1，SPC-A1 and PC-3 cells

WANG Wenjia，ZHANG Zhengquan，JIA Xin，LI Xuebing，ZHANG Zhenzhong School of Pharmaceutical Sciences，Zhengzhou University，Zhengzhou 450001

2-methoxyestradiol;verapamil;synergic index;4T1 cell;SPC-A1 cell;PC-3 cell

Aim:To explore growth inhibition effect of 2-methoxyestradiol(2-ME)on a variety of tumor cells.Methods: The study object was 4T1 cell strain of rat mastocarcinoma，SPC-A1 cell strain of human pulmonary adenocarcinoma and PC-3 cell strain of human prostate cancer.SRB method was adopted to investigate growth inhibition effect of 2-ME on the above tumor cells.In addition，verapamil and synergic index were used to explore the factors influencing 2-ME anti-cancer effect.Results:2-ME had inhibition effects on 4T1，SPC-A1 and PC-3 cells with IC50of 6.11，1.89 and 5.12 μmol/L，respectively.After verapamil was adopted，the inhibitory rate was significantly higher than that of the single-drug group(P＜0.01)，and IC50dropped to 2.01，0.57 and 2.77 μmol/L，respectively，with the synergic index distributed within 0.77～0.43.Conclusion:2-ME has inhibition effects on the three kinds of tumor cells，and verapamil has obvious synergistic effect on 2-ME.

R979.1

10.3969/j.issn.1671-6825.2012.06.017

(2012-03-11收稿 責(zé)任編輯趙秋民)