葉 蓉 王淑華

懷化市第一人民醫(yī)院，湖南懷化 418000

目前，乳腺癌已經(jīng)成為女性最為常見的一種惡性腫瘤，發(fā)病率在逐年增加。 根據(jù)國外的最新統(tǒng)計顯示，國外乳腺癌患者占惡性腫瘤中的30%，是惡性腫瘤的第一位[1]。 免疫組織化學(xué)法的操作簡單方便，價格比較低，是應(yīng)用比較廣泛的一種方法，但是假陽性比較高。 因此才需要熒光原位雜交法再次檢查，得到準(zhǔn)確的Her-2 基因的狀態(tài)，為診斷提供更為可靠的依據(jù)，對于治療上也可以依據(jù)準(zhǔn)確的Her-2 基因的狀態(tài)來選擇最合適的治療方案。該院針對這一現(xiàn)象，選取2009年3月—2011年3月手術(shù)切除的乳腺癌標(biāo)本48 例，對其采用熒光原位雜交法進(jìn)行檢測，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

該院2009年3月—2011年3月手術(shù)切除乳腺癌標(biāo)本48例，年齡在35～60 歲，平均年齡47.5 歲。 經(jīng)過10%的中性甲醛固定，然后用常規(guī)的石蠟包埋，進(jìn)行切片，HE 染色顯示結(jié)果，證實確實為乳腺癌。

1.2 方法

采用熒光原位雜交法：將標(biāo)本用10%的中性甲醛固定，固定于甲醛6～48 h，然后用常規(guī)的石蠟包埋，并且標(biāo)出雜交區(qū)域。 然后進(jìn)行切片處理，用65～75 ℃進(jìn)行烤片。 再使用二甲苯脫蠟呈水化，室溫下以100%、85%和70%的乙醇進(jìn)行2 min 的脫水，去離子水中浸泡3 min。在50 ℃的時候，浸入30%酸性亞硫酸鈉30 min，然后將用緩沖液洗片2 次，再放入37 ℃的蛋白酶K 溶液中，浸泡5～10 min。 再次進(jìn)行洗片，在室溫下放入0.1 mol/L HCL，浸泡5～10 min。 再次進(jìn)行洗片， 然后將玻片放在-20 ℃、70%、85%和100%的乙醇中進(jìn)行脫水，浸泡2 min 左右。 室溫下再浸入丙酮，浸泡2 min，再取出進(jìn)行自然風(fēng)干，制作成干片。 然后進(jìn)行烤片到56 ℃后，滴入探針混合液到雜交區(qū)，蓋玻片后采用蠟?zāi)z進(jìn)行封邊處理。 再放入雜交濕盒，進(jìn)行密封處理，在40 ℃的溫箱中存放14～18 min。最后將切片放入洗滌液中洗去多余的探針，放在暗處進(jìn)行干燥，最后滴加DAPI 顯色液復(fù)染，蓋上玻片，就可以放在顯微鏡下進(jìn)行觀察，并且將得到的結(jié)果進(jìn)行記錄。

采用免疫組織化學(xué)法：Her-2 蛋白表達(dá)檢測采用的是免疫組化ABC 法，同時要檢測ER、PR、P53 基因，而且要進(jìn)行記錄，還要記錄腋窩轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的數(shù)目，并且將結(jié)果記錄好進(jìn)行比對。

1.3 評定標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 熒光原位雜交法 在觀察癌細(xì)胞的時候進(jìn)行信號計數(shù)，在這個時候選擇細(xì)胞核大小基本相同，核的邊界完整，并且DAPI染色一樣，細(xì)胞核孤立沒有重疊，綠色信號顯示清晰，以及一般為兩個或以上信號點的細(xì)胞，進(jìn)行隨機(jī)的計數(shù)30 個細(xì)胞，統(tǒng)計30 個細(xì)胞核中紅色信號的總數(shù)和綠色信號的總數(shù)的比值， 這個統(tǒng)計一般稱為ratio。 ratio＜1.8 的時候為陰性，顯示這個樣本沒有Her-2 基因；ratio＞2.2 的時候為陽性， 顯示這個樣本中的Her-2基因發(fā)生了擴(kuò)增的情況；ratio 在1.8～2.2 的時候， 選擇增加計數(shù)細(xì)胞，或者是重新做一次應(yīng)該原位雜交檢查，再判定最終結(jié)果。

1.3.2 免疫組織化學(xué)法 Her-2 的陽性物質(zhì)在細(xì)胞膜，腫瘤的組織細(xì)胞膜沒有棕黃的染色或者僅僅是少于10%的腫瘤組織細(xì)胞膜有較弱的棕黃染色屬于（-）；＞10%的腫瘤組織的部分細(xì)胞膜出現(xiàn)不完整而且比較弱的棕黃染色屬于（+）；＞10%腫瘤組織細(xì)胞膜出現(xiàn)完整而且比較弱或者是中等強(qiáng)度的棕黃染色屬于（++）；＞10%腫瘤組織細(xì)胞膜全部呈高強(qiáng)度的棕黃染色屬于（+++）[2]。

1.4 觀察指標(biāo)

主要是觀察采用熒光原位雜交法檢測乳腺癌中Her-2 基因的臨床病理意義。

1.5 統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)都經(jīng)過專業(yè)的統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行處理。 計量數(shù)據(jù)都采用t 檢驗，所有的計數(shù)數(shù)據(jù)采用χ2進(jìn)行檢驗。

2 結(jié)果

經(jīng)過熒光原位雜交法檢測后發(fā)現(xiàn)， 免疫組織化學(xué)法檢測Her-2 蛋白表達(dá)++的標(biāo)本中Her-2 基因擴(kuò)增的有11 例， 比例為27.5%；Her-2 基因無擴(kuò)增的有29 例，比例為72.5%。 免疫組織化學(xué)法檢測Her-2 蛋白表達(dá)+++的標(biāo)本中Her-2 基因擴(kuò)增的有6例， 比例為75.0%；Her-2 基因無擴(kuò)增的有2 例， 比例為25.0%。Her-2 蛋白免疫組織化學(xué)法表達(dá)強(qiáng)度高，患者Her-2 基因擴(kuò)增的可能性就越大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。 見表1。

表1 乳腺癌Her-2 基因擴(kuò)增與Her-2 蛋白的關(guān)系[n(%)]

3 討論

因現(xiàn)代生物學(xué)以及相關(guān)科學(xué)的發(fā)展速度比較快， 所以對于Her-2 基因的研究以及相關(guān)的一些治療，在國外以及國內(nèi)都得到了很高的重視。 根據(jù)大量的臨床研究可以發(fā)現(xiàn)，Her-2 基因過度表達(dá)，表示乳腺癌有早期復(fù)發(fā)的傾向，而且患者的生命在縮短，治療方法上，化療和三苯氧胺的治療效果都不是很好。 在美國采用的是注射曲妥珠單抗，曲妥珠單抗是一種新型、低毒、高效并且選擇性強(qiáng)的一種治療藥物。 曲妥珠單抗主要是抗Her-2 基因的單克隆抗體，這種注射藥物只對Her-2 高表達(dá)的乳腺癌患者有效，所以在治療以前要對患者進(jìn)行Her-2 基因的檢測，這樣熒光原位雜交法在臨床上就更加至關(guān)重要了[3]。 在該次試驗中熒光原位雜交法和免疫組織化學(xué)法的檢測結(jié)果都是比較好的。 而且檢測乳腺癌組織中的Her-2 基因的情況，可以作為判斷乳腺癌預(yù)后的獨立指標(biāo)， 更方便的指導(dǎo)臨床上可以選用合適的治療方案。 但免疫組織化學(xué)法的假陽性比較高，因此需要熒光原位雜交法再次檢查，得到準(zhǔn)確的Her-2 基因的狀態(tài)。

綜合上述情況， 應(yīng)用熒光原位雜交法檢測乳腺癌Her-2 基因，結(jié)果的準(zhǔn)確性是很高的，準(zhǔn)確的結(jié)果可以幫助更加深入的研究以及在臨床病理特征的關(guān)系，對于診斷也有更為可靠的依據(jù)，對于乳腺癌的預(yù)后以及治療都會很重要的意義。

[1] 劉冰. 乳腺癌患者HER-2 基因的熒光原位雜交法檢測與分析[D].大連：大連醫(yī)科大學(xué), 2009.

[2] 蘇靜，楊郁，馬曉龍，等. 熒光原位雜交檢測乳腺癌人表皮生長因子受體2 基因擴(kuò)增及與臨床病理特征的關(guān)系[J].北京大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版).2011(2):199-203.

[3] 張偉，彭大云，陳曉東，等. 乳腺癌HER2 基因熒光原位雜交與顯色原位雜交檢測對比研究[J]. 華南國防醫(yī)學(xué)雜志. 2011(1): 13-15.