鐘 華， 胡清華， 王恩幫， 趙 丹， 孫志萍， 司軍強(qiáng)， 何 芳△

(1 新疆地方病與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院2 病理生理教研室，3醫(yī)學(xué)機(jī)能實(shí)驗(yàn)中心，新彊 石河子832002;4 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系，衛(wèi)生部呼吸系疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢430030;5 鄖陽醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，湖北 十堰442000)

血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)增殖、遷移和表型變化導(dǎo)致的血管壁增厚和血管緊張度增加是高血壓發(fā)病的關(guān)鍵。由縫隙連接蛋白(connexin，Cx)構(gòu)成的細(xì)胞間直接通訊——縫隙連接(gap junction，GJ)在調(diào)節(jié)血管舒縮、血管平滑肌細(xì)胞增殖、平滑肌表型轉(zhuǎn)變中起著重要作用，并與高血壓發(fā)生密切相關(guān)［1］。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor β1，TGF - β1)血漿水平升高與高血壓的發(fā)生密切相關(guān)［2］，在已研究證實(shí)的機(jī)制中均涉及細(xì)胞間通訊方式［2-4］。TGF-β1血漿水平升高是否通過改變Cx 的表達(dá)并調(diào)節(jié)縫隙連接通道的功能，影響細(xì)胞間直接通訊，導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞增殖有待證實(shí)?；谏鲜銮闆r，本研究以TGF-β1與自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneous hypertensive rat，SHR)血管平滑肌細(xì)胞共孵育為細(xì)胞模型，配合使用縫隙連接通道的阻斷劑18α-甘草次酸(18α-glycyrrhetinic acid，18α-GA)，應(yīng)用染料示蹤分子傳遞法、Western blotting、免疫熒光染色、流式細(xì)胞術(shù)和MTT 法，觀察不同干預(yù)條件下縫隙連接蛋白表達(dá)和縫隙連接功能變化及對(duì)SHR 血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響，闡明縫隙連接在TGF -β1誘導(dǎo)的SHR血管平滑肌細(xì)胞增殖中的作用及分子機(jī)制，為高血壓的防治提供新靶標(biāo)。

材 料 和 方 法

1 主要材料和試劑

1.1 材料 3 ～10 周齡，150 ～200 g 自發(fā)性高血壓大鼠，雌雄不限，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)為SCXK(京)2007 -0001。

1.2 主要試劑 DMEM 培養(yǎng)基(Gibco)，胎牛血清/小牛血清(HyClone)，胰蛋白酶(Sigma)，TGF - β1(Sigma)，18α-GA(Sigma)，抗α -actin 單克隆抗體(Dako)，抗Cx40 單克隆抗體(Invitrogen)，抗Cx43單克隆抗體(Invitrogen)，羅氏黃(lucifer yellow，LY;Molecular Probes)，羅丹明-葡聚糖(rhodamine-dextran，RD;Molecular Probes)，發(fā)光試劑盒(Pierce)。

2 方法

2.1 VSMCs 的培養(yǎng)和鑒定 取3 ～10 周齡，150 ～200 g 自發(fā)性高血壓大鼠，雌雄不限，斷頭處死。無菌條件下取胸主動(dòng)脈，以貼塊法培養(yǎng)VSMCs，細(xì)胞生長(zhǎng)融合后，用0.25%胰蛋白酶消化，以106～107/L的密度傳代培養(yǎng)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察并對(duì)細(xì)胞內(nèi)平滑肌肌動(dòng)蛋白α - actin 進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，95% 以上的細(xì)胞呈陽性著色，證實(shí)細(xì)胞為VSMCs。取3 ～5 代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組 將細(xì)胞以5 ×107/L 的密度培養(yǎng)24 h 后吸去孔內(nèi)液體，加入無血清培養(yǎng)基，24 h 后再次吸去孔內(nèi)液體，按以下分組加入試劑:(1)對(duì)照組:加10%FBS 的DMEM;(2)TGF -β1組:加10%FBS的DMEM 和10 μg/L TGF-β1;(3)縫隙連接阻斷劑組:加含10%FBS 的DMEM 和50 mmol/L 18α-GA。(4)TGF-β1+縫隙連接阻斷劑組:加含10%FBS 的DMEM、10 μg/L TGF-β1和50 mmol/L 18α-GA。

2.3 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)Cx40 和Cx43 在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)及共定位 按實(shí)驗(yàn)分組制作細(xì)胞爬片，用PBS 洗3 遍，4%預(yù)冷的多聚甲醛固定20 min 后用含0.2% 非離子型表面活性劑Triton 的PBS 液洗3 遍，0.2%Triton X-100 室溫透膜30 min，含0.2% Triton的PBS 洗3 遍，血清封閉30 min，含0.2% Triton 的PBS 洗3 遍，加入Cx40 (1∶100)和Cx43(1∶50)Ⅰ抗4 ℃濕盒內(nèi)過夜，含0.2% Triton 的PBS 洗3 遍后，加入異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記Ⅱ抗(1∶50);四甲基異硫氰酸羅丹明(tetraethyrodamine isothiocyanate，TRITC)標(biāo)記Ⅱ抗(1∶50)，室溫避光孵育2 h，含0.2% Triton 的PBS 沖洗3 次，加核染料4'，6 -二脒基-2 -苯基吲哚(4'，6 -diamidino-2 -phenylindole，DAPI)(1∶1 000)室溫避光孵育15 min，含0.2%Triton 的PBS 洗3 遍，60%緩沖甘油封片，激光共聚焦顯徽鏡下觀察，實(shí)驗(yàn)中設(shè)立陰性對(duì)照、陽性對(duì)照和空白對(duì)照。

2.4 MTT 法檢測(cè)VSMCs 的增殖活性 制備細(xì)胞懸液，用含10%FBS 的DMEM 液稀釋成5 ×107/L，接種于96 孔板，每孔加入200 μL 混勻后的細(xì)胞懸液，置于37 ℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育24 h。棄去培養(yǎng)液，用PBS 液沖洗1 ～2 遍。每孔加入不含F(xiàn)BS的DMEM 液，各200 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞同步于G0/G1期。棄去培養(yǎng)液，分別按實(shí)驗(yàn)分組加入試劑，每組8 個(gè)復(fù)孔，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后，各組棄去培養(yǎng)液，每孔加入MTT 20 μL，孵育4 h，加入二甲基亞砜(dimathyl sulfoxide，DMSO)150 μL，于酶標(biāo)儀上檢測(cè)各孔570 nm 處吸光度(A 值)。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 在6 孔板內(nèi)各組試劑作用24 h 后吸凈孔內(nèi)培養(yǎng)基，PBS 沖洗2 次，1 000 r/min 離心8 min，棄上清液加PBS 液吹打均勻，1 000 r/min 離心4 min，重復(fù)2 次，棄上清液加PBS 液吹打均勻，然后加入70%乙醇4 ℃過夜，至少18 h，1 000 r/min 離心5 min，加PBS 重懸離心同上，重復(fù)2 次后，加碘化丙啶(propidium iodide，PI)染液0.5 mL，置于4 ℃，30 min 后上流式細(xì)胞儀，重復(fù)4次，進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)，通過特殊軟件計(jì)算S 期的百分率，以反映細(xì)胞增殖能力。

2.6 Western blotting 法檢測(cè)SHR VSMCs 內(nèi)Cx40、Cx43 蛋白表達(dá) 在6 孔板內(nèi)各組試劑作用24 h 后吸凈孔內(nèi)培養(yǎng)基，預(yù)冷PBS 沖洗3 次，加入細(xì)胞裂解液200 μL，吹打，轉(zhuǎn)入1.5 mL EP 管中，保持冰上30 min 后4 ℃離心，12 000 r/min 離心10 min，取上清用5 ×加樣緩沖液以4∶1 的比例稀釋，煮沸6 ～8 min，BCA 法測(cè)蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，-20 ℃保存。所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3 次。以上蛋白樣品(30 μg)經(jīng)10 %聚丙烯凝膠電泳分離后，恒壓25 V 電轉(zhuǎn)移50 min 到硝酸纖維素濾膜(NC)上，然后封閉緩沖液(5%脫脂牛奶或牛血清白蛋白)中封閉1 h。將膜放入用5% 封閉液稀釋的Ⅰ抗(Cx43 稀釋比例為1∶1 000;Cx40 稀釋比例為1 ∶200)中，在室溫下孵育，持續(xù)搖動(dòng)2 h。1 ×TBST(10mmol/L Tris - HCl，pH 7.4，150 mmol/L 氯化鈉，0.05% Tween -20)洗膜，將膜用封閉緩沖液稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的第Ⅱ抗體(1∶2 000 稀釋)，室溫作用2 h，1 ×TBST 洗膜，新鮮配制的ECL 顯色液1 mL(A、B液等體積混勻)和膜孵育1 min，封入保鮮膜中，壓片，顯影于感光膠片上。將經(jīng)以上處理的NC 膜用洗脫緩沖液(strip buffer)室溫孵育1 h 后，洗膜3 次，每次15 min。用β -actin 內(nèi)參抗體(1∶1 000)室溫孵育2 h，以同樣方法顯影于感光膠片。用Bandleader 3.0 軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度掃描，按下述公式分別計(jì)算3 次實(shí)驗(yàn)中樣品蛋白的相對(duì)含量:蛋白相對(duì)含量(該蛋白條帶的灰度值-背景的灰度值)/(對(duì)照條帶的灰度值- 背景的灰度值)，以此比值計(jì)算均數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)差。

2.7 染料示蹤分子傳遞法(劃痕標(biāo)記染料傳輸法)

檢測(cè)血管平滑肌細(xì)胞間縫隙連接功能:在6 孔板內(nèi)各組試劑作用24 h 后吸凈孔內(nèi)培養(yǎng)基，以37 ℃預(yù)溫的PBS 沖洗細(xì)胞3 次，加熒光染料0.05%LY 和0.05%RD 的1∶1 混合液，每孔1 mL，用銳利的外科手術(shù)刀在細(xì)胞表面上劃痕數(shù)條并計(jì)時(shí)，孵育3 min 吸出熒光染料，PBS 沖洗細(xì)胞3 次，然后加入少量PBS以剛好覆蓋細(xì)胞為宜，熒光顯微鏡下觀察，LY 熒光的顯示用FITC 系統(tǒng)的濾光片，RD 用羅丹明系統(tǒng)濾光片，LY 熒光染料傳遞百分?jǐn)?shù)=LY 熒光陽性細(xì)胞數(shù)(劃痕細(xì)胞外)/劃痕標(biāo)記的細(xì)胞(即RD+LY 陽性細(xì)胞數(shù))，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次，統(tǒng)計(jì)分析后，以此代表縫隙連接功能的強(qiáng)弱。其大小代表細(xì)胞間縫隙連接通訊功能強(qiáng)弱。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 免疫熒光技術(shù)檢測(cè)SHR VSMCs 中Cx43 與Cx40 蛋白的表達(dá)及兩者的共定位

共聚焦熒光顯微鏡下觀察，綠色熒光為Cx43 的陽性著色，主要定位于胞漿，紅色熒光為Cx40 的陽性著色，主要定位于胞漿與胞膜，橙色熒光為兩者的重疊熒光，主要定位于胞漿，藍(lán)色熒光顯示為細(xì)胞核的DNA 染料(DAPI)陽性著色，可見SHR VSMCs 中Cx43 和Cx40 蛋白表達(dá)呈陽性，兩者共定位于胞漿，見圖1。

Figure 1. The expression and co-localization of Cx43 and Cx40 proteins in SHR VSMCs(×400).圖1 SHR VSMCs 中Cx43 與Cx40 蛋白的表達(dá)及兩者的共定位

2 VSMCs 的增殖

2.1 各實(shí)驗(yàn)組VSMCs 的增殖活性 與對(duì)照組相比，TGF-β1組的A 殖增高(P ＜0.05)，VSMCs 增殖活性增加，18α - GA 組的A 值降低(P ＜0.05)，VSMCs 增殖活性減少，TGF -β1+18α -GA 組A 值無明顯差異(P ＞0.05);與TGF -β1組相比，TGF -β1+18α-GA 組A 值明顯降低(P ＜0.05)，VSMCs增殖活性減少，見表1。

2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期 結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，TGF - β1組S 期比例增高(P ＜0.05)，VSMCs 增殖能力增加，18α-GA 組S 期比例降低(P＜0.05)，VSMCs 增殖能力減弱，TGF - β1+18α -GA 組S 期比例比無顯著差異(P ＞0.05);與TGF -β1組相比，TGF-β1+18α -GA 組S 期比例明顯降低(均P ＜0.05)VSMCs，增殖能力減弱，見圖2、3。

表1 MTT 法測(cè)得各組SHR VSMCs 的A 值Table 1. The A values of SHR VSMCs in different groups detected by MTT(±s.n=10)

表1 MTT 法測(cè)得各組SHR VSMCs 的A 值Table 1. The A values of SHR VSMCs in different groups detected by MTT(±s.n=10)

* P ＜0.05 vs control group;△P ＜0.05 vs TGF-β1 group.

Group A 570 Control 0.34 ±0.04 TGF-β1 0.39 ±0.04*18α-GA 0.27 ±0.02＊△TGF-β1 +18α-GA 0.31 ±0.02△

3 Western blotting 法檢測(cè)SHR VSMCs 內(nèi)Cx40和Cx43 蛋白表達(dá)

與對(duì)照組相比，TGF-β1組Cx43 蛋白表達(dá)增強(qiáng)(P ＜0.05)，Cx40 表達(dá)無顯著差異(P ＞0.05)，18α-GA 組Cx43 和Cx40 表達(dá)均減弱(P ＜0.05)，TGF-β1+18α - GA 組Cx40 和Cx43 表達(dá)無顯著差異(P ＞0.05);與TGF -β1組相比，TGF -β1+18α -GA 組Cx43 表達(dá)減弱(P ＜0.05)，Cx40 表達(dá)無顯著差異(P ＞0.05)，見圖4、5。

4 染料示蹤分子傳遞法檢測(cè)血管平滑肌細(xì)胞間縫隙連接功能

與對(duì)照組相比TGF -β1組，熒光染料傳遞分?jǐn)?shù)增加，縫隙連接功能明顯增強(qiáng)(P ＜0.05)，18α -GA組熒光染料傳遞分?jǐn)?shù)降低，縫隙連接功能明顯減弱(P ＜0.05)，TGF-β1+18α-GA 組熒光染料傳遞分?jǐn)?shù)無明顯差異，縫隙連接功能無顯著差異(P ＞0.05);與TGF-β1組相比，TGF -β1+18α -GA 組熒光染料傳遞分?jǐn)?shù)降低，縫隙連接功能顯著降低(P＜0.05)，見圖6、7。

Figure 2. The PI atlas of cell cycle of SHR VSMCs from different groups. A:control group ;B:TGF-β1 group;C:18α-GA agent group;D:TGF-β1 + 18α-GA group.圖2 各組細(xì)胞細(xì)胞周期PI 圖譜

Figure 3. The percentage of S - phase in cell cycle of SHR VSMCs from different groups. ±s.n =4. * P ＜0.05 vs control group;△P ＜0.05 vs TGF-β1 group.圖3 各組細(xì)胞細(xì)胞周期S 期所占百分?jǐn)?shù)

Figure 4. Expression of the Cx43 and Cx40 proteins examined by Western blotting in SHR VSMCs from different groups. A:control group ;B:TGF - β1 group;C:18α - GA agent group;D:TGF - β1 + 18α - GA group.圖4 各組Cx43 和Cx40 蛋白的表達(dá)

Figure 5. The expression of Cx43 and Cx40 proteins in VSMCs from different groups. ±s.n=3. * P ＜0.05 vs control group;△P ＜0.05 vs TGF-β1 group.圖5 各組Cx43 和Cx40 蛋白的表達(dá)

Figure 6. The atlas of gap junction function in VSMCs from different groups. A:control group ;B:TGF-β1 group;C:18α -GA agent group;D:TGF -β1 + 18α -GA group.圖6 檢測(cè)各組縫隙連接功能圖

Figure 7. The percentage of fluorescent dye transfer in SHR VSMCs from different groups. ±s.n =3. * P ＜0.05 vs control group;△P ＜0.05 vs TGF-β1 group.圖7 各組熒光染料傳遞百分?jǐn)?shù)

討 論

血管平滑肌舒縮是依賴細(xì)胞間的信號(hào)物質(zhì)進(jìn)行調(diào)節(jié)的。平滑肌細(xì)胞之間相互調(diào)節(jié)作用除了由旁分泌及自分泌介導(dǎo)的間接通訊外，可能還涉及由縫隙連接介導(dǎo)直接通訊的作用［5］。

縫隙連接是由連接相鄰兩個(gè)細(xì)胞之間的連接通道排列而成的一種特殊膜結(jié)構(gòu)。它由細(xì)胞膜上的連接子相互銜接而成，每個(gè)連接子由6 個(gè)Cx 圍成，形成跨膜蛋白通道［6］。不同類型的連接蛋白可以形成不同類型的連接子，構(gòu)成不同類型的連接通道，不同連接蛋白分子之間組合形成的縫隙連接通道的通透性和導(dǎo)電性有所不同［7］，從而使得縫隙連接在結(jié)構(gòu)組成和功能上表現(xiàn)出多樣性［8］，并對(duì)血管平滑肌舒縮等生理過程起著重要的調(diào)控作用。而血管平滑肌細(xì)胞以Cx43 和Cx40 表達(dá)為主。

TGF-β1是一種多功能細(xì)胞因子，能調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化，其作用取決于細(xì)胞密度、組織來源、TGF-β 濃度，對(duì)于血管平滑肌細(xì)胞的增殖以及介導(dǎo)高血壓等心血管疾病的發(fā)生起著重要的作用。在我們前期的研究中顯示:與正常血壓大鼠組相比，SHR VSMCs A 值和S 期比例都明顯升高，提示SHR 血管平滑肌細(xì)胞本身就處在增殖狀態(tài)，且TGF - β1對(duì)SHR VSMCs 增殖活性具有明顯的促進(jìn)作用，并隨著TGF- β1濃度的升高而逐漸增強(qiáng)［9］，與相關(guān)文獻(xiàn)一致。

本實(shí)驗(yàn)中我們分別用TGF-β1和縫隙連接阻斷劑18α-GA 處理SHR VSMCs，發(fā)現(xiàn)TGF -β1進(jìn)一步促進(jìn)了細(xì)胞的增殖，當(dāng)縫隙連接阻斷后，完全組斷了TGF-β1對(duì)細(xì)胞的促增殖效應(yīng)。本研究結(jié)果首次證實(shí)，縫隙連接可能參與了TGF - β1誘導(dǎo)的SHR VSMCs 的增殖作用。

為了進(jìn)一步探討TGF-β1是否通過改變連接蛋白的表達(dá)，調(diào)節(jié)縫隙連接通道的功能，影響細(xì)胞間直接通訊，并導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞增殖，在本研究中我們用激光共聚焦顯微鏡觀察Cx43 和Cx40 蛋白表達(dá)及定位，結(jié)果顯示兩者共定位于胞漿，并通過Western blotting 各組Cx43 和Cx40 的蛋白表達(dá)，結(jié)合劃痕標(biāo)記染料傳輸法檢測(cè)了縫隙連接功能的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn):TGF-β1處理使SHR 血管平滑肌細(xì)胞Cx43 蛋白表達(dá)上調(diào)，增強(qiáng)了縫隙連接通訊功能?？p隙連接阻斷劑抑制了TGF-β1引發(fā)的Cx43 蛋白表達(dá)上調(diào);并降低了縫隙連接功能，因此我們認(rèn)為TGF -β1主要通過上調(diào)SHR 血管平滑肌細(xì)胞Cx43 蛋白表達(dá)，引起縫隙連接通訊功能增強(qiáng)，從而促進(jìn)了SHR 血管平滑肌細(xì)胞的增殖作用，而Cx40 蛋白表達(dá)可能不起主要作用。

此外，縫隙連接功能的調(diào)節(jié)受多種因素的影響，如縫隙連接蛋白的表達(dá)、縫隙連接蛋白的磷酸化等，在本研究中我們僅就縫隙連接蛋白的表達(dá)做了初步研究，而縫隙連接在TGF -β1誘導(dǎo)的正常大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖中的作用及其機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

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