龍啟成， 桂 春△， 朱立光， 農(nóng)勤玲， 鄧 燕， 鄧天賜

(廣西醫(yī)科大學(xué)1 第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，2 第一附屬醫(yī)院超聲診斷科，3 病理學(xué)教研室，廣西 南寧530021)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)的主要并發(fā)癥之一，它是指排除冠心病、瓣膜性心臟病和高血壓等因素，以左心室功能障礙為主的心肌病，其病理生理學(xué)改變包括代謝紊亂、心肌纖維化、心肌細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、微血管和心臟自主神經(jīng)病變等。在DCM中，許多細(xì)胞因子都被激活，如血管緊張素II、轉(zhuǎn)化生長因子、胰島素樣生長因子和炎癥因子［1－3］，而血管內(nèi)皮生長因子和血管生成素－1 及相關(guān)受體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)明顯受損［4－5］。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1(neuregulin－1，NRG－1)是表皮生長因子家族的成員，其受體為酪氨酸激酶家族的跨膜受體ErbB。NRG－1/ErbB 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在心血管系統(tǒng)的發(fā)育和成年心臟功能的維護(hù)中起著至關(guān)重要的作用。有研究表明NRG－1 能促進(jìn)心肌細(xì)胞的生存［6］，降低氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞增殖和對心臟損傷進(jìn)行修復(fù)［7］。NRG1/ErbB 系統(tǒng)是否參與DCM 的發(fā)展尚不明確。本研究以糖尿病大鼠為對象，探討NRG－1 在糖尿病大鼠心肌中的表達(dá)變化。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

采用8 周齡雄性SD 大鼠，體重180 ～200 g，屬于無特定病原體(SPF)級動(dòng)物，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證編號為SCXK 桂2009－0002)。

2 主要試劑及儀器

鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)購自Sigma，多克隆羊抗NRG－1 抗體和羊抗兔IgG－HRP 抗體分別購自Abcam 和Bioworld Technology，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和Trizol 購自Fermentas，2 ×Taq PCR Master Mix 和磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體分別購自北京天根公司和上?？党缮锕?。血糖儀和心臟實(shí)時(shí)三維超聲診斷儀分別購自羅氏有限公司和飛利浦公司。

3 方法

3.1 動(dòng)物分組與模型的建立 45 只SD 大鼠按電腦隨機(jī)數(shù)法分為4 周、8 周和12 周糖尿病組(4th、8th和12th DM 組，各組n=10)，4 周、8 周和12 周對照組(4th、8th 和12th C 組，各組n=5)。禁食12 h 后，各DM 組大鼠一次性腹腔內(nèi)注射STZ 溶液55 mg/kg(檸檬酸鹽緩沖液溶解，pH 4.3，濃度為10 g/L);各C 組大鼠注射等體積檸檬酸鹽緩沖液。7 d 后取鼠尾靜脈血測空腹血糖。參考文獻(xiàn)［8］，血糖大于16.7 mmol/L 并出現(xiàn)多飲、多食、多尿和消瘦者納入DM模型。

3.2 心功能測定和取材 實(shí)驗(yàn)的第4、8 和12 周，腹腔注射戊巴比妥鈉溶液麻醉后，采用超聲診斷儀盲法檢測大鼠左室舒張末內(nèi)徑(left ventricular end－diastolic dimension，LVEDD)、左室收縮末內(nèi)徑(left ventricular systolic dimension，LVESD)、左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)和左室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening，LVFS)，取5 個(gè)心動(dòng)周期的平均值。完成心功能檢測后，處死大鼠，分離出左室心肌組織，于左室赤道面橫切，取適量心肌組織分別放入液氮灌和4%甲醛溶液中保存?zhèn)溆谩?/p>

3.3 心肌膠原纖維染色(Masson 染色)及免疫組化染色 4%甲醛溶液固定的心肌組織經(jīng)過脫水、透明、浸蠟、包埋后，分別在心尖、中部和基底部以厚度4 μm 各連續(xù)切片2 張，其中不同部位的3 張行Masson 染色，光鏡下每個(gè)標(biāo)本選取5 個(gè)視野，應(yīng)用Image－Pro Plus 6.0 圖像分析系統(tǒng)測定心肌膠原容積分?jǐn)?shù)(心肌膠原容積分?jǐn)?shù)=視野中膠原面積/視野心肌總面積)。余下3 張用梯度酒精脫蠟和水化后，0.01 mmol/L PBS 洗2 次，滴加3%過氧化氫，室溫孵育10 min，PBS 洗3 次，切片置修復(fù)液中微波爐加熱10 s，PBS 洗2 次。滴加封閉液，置于濕盒中封閉60 min，分別加入1∶75 稀釋的NRG－1 抗體，4 ℃過夜。用PBS 洗3 次后滴加SABC 試劑免疫組化染色，DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染，封片。光鏡下以細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜染成密集棕黃色為陽性，散在淡棕黃色為弱陽性，無棕黃色為陰性。

3.4 左室心肌組織NRG－1 mRNA 表達(dá)的測定

取出液氮保存的心肌組織，先用Trizol 提取標(biāo)本的總RNA，測定總RNA 的濃度，再用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，最后進(jìn)行PCR 反應(yīng)。引物根據(jù)GenBank 提供的基因序列，使用Primer Design 軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，由上海生工公司合成，見表1。RT－PCR 反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃45 s，55 ℃30 s，72 ℃30 s，擴(kuò)增30 個(gè)循環(huán)，最后72 ℃10 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)上進(jìn)行掃描，以β－actin 為內(nèi)參照，比較各組NRG－1 mRNA 表達(dá)的變化。

表1 RT－PCR 引物序列Table 1. The sequences of RT－PCR primers

3.5 左室心肌組織NRG－1 蛋白表達(dá)的測定

Western blotting 方法測定心肌組織NRG－1 蛋白的表達(dá)。取心肌組織約50 mg，加入RIPA 蛋白裂解液400 μL 和PMSF 4 μL 進(jìn)行總蛋白的提取，BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定樣本蛋白的濃度。蛋白于12%SDS－聚丙酰胺凝膠電泳70 min，濕法電轉(zhuǎn)2 h 轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PDVF)膜后，剪出目的條帶，以6%脫脂奶封閉1.5 h，再加NRG－1 Ⅰ抗(1∶350)進(jìn)行抗體結(jié)合，4 ℃過夜，TBST 洗膜后加羊抗兔IgG－HRP(1∶10 000)室溫下孵育1 h，TBST 洗膜后滴加ECL 檢測試劑混合液在暗室中顯影。以GAPDH(1∶10 000)為內(nèi)參抗體。用Quantity One 成像系統(tǒng)進(jìn)行蛋白條帶的灰度值分析，以NRG－1 蛋白與GAPDH 蛋白條帶的灰度積分比值來代表目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)量，分析結(jié)果。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組間比較用t 檢驗(yàn)，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 動(dòng)物模型建立的情況

DM 組不達(dá)標(biāo)大鼠4 只。飼養(yǎng)過程中死亡6 只均為糖尿病大鼠，可能死于感染或糖尿病高滲昏迷。最終4th、8th 和12th C 組均為5 只，4th 和8th DM 組各7 只，12th DM 組6 只。

2 大鼠心功能檢測情況

4th DM 組大鼠心功能指標(biāo)與同期對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P ＞0.05);8th DM 組LVESD顯著高于同期對照組(P ＜0.05)，而LVEDD、LVFS和LVEF 均較同期對照組稍低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P ＞0.05);12th DM 組LVESD 顯著高于同期對照組，LVEDD、LVFS 和LVEF 均顯著低于同期對照組，見表2。

表2 各組大鼠的心功能檢測指標(biāo)的比較Table 2. The echocardiographic parameters of rats in each group(±s)

表2 各組大鼠的心功能檢測指標(biāo)的比較Table 2. The echocardiographic parameters of rats in each group(±s)

* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control (C)group at the same time point.

Group n LVEDD(mm) LVESD(mm) LVEF(%) LVFS(%)4.40 4th DM 7 5.54±0.29 2.57±0.35 82.70±4.29 52.80±3.89 8th C 5 6.18±0.38 3.02±0.27 84.30±2.46 51.40±4.23 8th DM 7 5.63±0.33 3.79±0.41* 82.50±3.24 48.30±6.50 12th C 5 6.99±0.32 3.01±0.32 83.60±2.97 53.30±8.37 12th DM 6 5.72±0.31* 3.79±0.39* 71.50±4.53＊＊ 40.10±3.91 4th C 5 5.81±0.37 2.61±0.24 83.90±3.13 51.20±＊＊

3 大鼠左室心肌組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

3.1 Masson 染色及心肌膠原容積分?jǐn)?shù) 4th DM 組大鼠左室心肌組織經(jīng)Masson 染色在光鏡下未發(fā)現(xiàn)明顯心肌間質(zhì)或微血管壁纖維化;8th 和12th DM 組在光鏡下可見心肌細(xì)胞空泡樣改變，心肌間質(zhì)和微血管壁纖維化明顯，粗大膠原纖維相互連接成網(wǎng)狀排列紊亂，分布不均，顯天藍(lán)色。計(jì)算心肌CVF(%)發(fā)現(xiàn)，4th DM 組心肌CVF 與同期對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(1.90 ± 0.21 vs 2.09 ± 0.29，P ＞0.05);8th 和12th DM 組心肌CVF 均明顯高于同期對照組(10.23 ±2.69 vs 1.87 ±0.37，17.29 ±4.67 vs 1.99 ±0.41，均P ＜0.01)，見圖1。

Figure 1. Masson staining of left ventricular myocardial tissues (× 100)and myocardial tissue CVF of rats. A:4th control group;B:4th DM group;C:8th control group;D:8th DM group;E:12th control group;F:12th DM group. ＊＊P ＜0.01 vs control group at the same time point.圖1 大鼠左室心肌Masson 染色圖像及心肌膠原容積分?jǐn)?shù)

3.2 NRG－1 蛋白在大鼠心肌組織中表達(dá)的部位

免疫組化染色后，可見大鼠左室心內(nèi)膜、心肌內(nèi)層及微血管內(nèi)膜呈棕黃色即NRG－1 表達(dá)呈陽性，其它區(qū)域無棕黃色著色或呈稀疏淺棕色，即NRG－1 表達(dá)陰性或弱陽性，見圖2。

Figure 2. Expression of NRG－1 protein in rat myocardial tissues (immunohistochemical staining，×100)圖2 NRG－1 蛋白在大鼠心肌組織中的表達(dá)

4 左室心肌組織NRG－1 mRNA 及蛋白的表達(dá)

RT－PCR 和Western blotting 結(jié)果顯示，4th 和8th DM 組大鼠左室心肌組織NRG－1 mRNA 及蛋白的表達(dá)與同期對照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，12th DM 組心肌組織NRG－1 mRNA 及蛋白的表達(dá)較同期對照組均顯著下調(diào)(均P ＜0.01)，見圖3、4。

Figure 3. The expression of NRG－1 mRNA in myocardial tissues of rats at different time points. M:marker;a:4th C group;b:4th DM group;c:8th C group;d:8th DM group;e:12th C group;f:12th DM group. ＊＊P ＜0.01 vs 12th C group. C:control;DM:diabetes mellitus.圖3 大鼠不同時(shí)期心肌NRG－1 mRNA 表達(dá)的比較

討 論

本研究發(fā)現(xiàn):(1)在糖尿病早期，大鼠心臟結(jié)構(gòu)即發(fā)生改變，心肌肥大，并逐漸出現(xiàn)纖維化;(2)隨著病程的發(fā)展，糖尿病大鼠出現(xiàn)心功能不全，并逐漸惡化;(3)在糖尿病的早期，大鼠心肌組織NRG－1 的表達(dá)無明顯改變，而隨著病程的發(fā)展，NRG－1 的表達(dá)出現(xiàn)顯著下調(diào)。

Figure 4. The expression of NRG－1 protein in myocardial tissues of rats (Western blotting). 1:4th C group;2:4th DM group;3:8th C group;4:8th DM group;5 and 7:12th C group;6 and 8:12th DM group. ＊＊P ＜0.01 vs 12th C group.圖4 NRG－1 蛋白在大鼠心肌組織中表達(dá)水平的比較

DCM 主要表現(xiàn)為心肌肥大、纖維化，心肌順應(yīng)性下降，并逐漸出現(xiàn)心功能障礙。本研究在誘導(dǎo)糖尿病4 周后大鼠出現(xiàn)心肌肥大，隨后心肌纖維化，并逐漸出現(xiàn)心功能不全，說明大鼠已并發(fā)DCM。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，STZ 誘導(dǎo)糖尿病大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)的改變發(fā)生在誘導(dǎo)糖尿病后4 ～6周［9］，與本研究觀察結(jié)果一致。許多因素可影響心臟的結(jié)構(gòu)和功能，包括代謝紊亂、氧化應(yīng)激、微血管和心臟自主神經(jīng)病變等。有研究表明，高血糖引發(fā)氧化應(yīng)激可提高晚期糖基化終產(chǎn)物及其受體的表達(dá)，激活核轉(zhuǎn)錄因子，改變心肌收縮力;同時(shí)，晚期糖基化終產(chǎn)物積聚還可改變心臟結(jié)構(gòu)蛋白，導(dǎo)致心臟I 型和Ⅲ型膠原沉積誘發(fā)心肌間質(zhì)纖維化［10］，支持本研究結(jié)果。

本研究免疫組化染色結(jié)果提示，NRG－1 主要在微血管內(nèi)皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞較多的心內(nèi)膜中表達(dá)，與NRG－1 主要由心內(nèi)膜和心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞合成和釋放相吻合［6］。有研究顯示左室組織NRG－1的表達(dá)在左室發(fā)生向心性肥厚的初期顯著升高，而當(dāng)左室出現(xiàn)偏心性肥厚和泵衰竭時(shí)顯著下降［6］。本研究在誘導(dǎo)糖尿病4 或8 周后，大鼠心肌組織NRG－1 的表達(dá)并未發(fā)生明顯改變，而在誘導(dǎo)糖尿病12周后，大鼠心肌組織NRG－1 的表達(dá)顯著下調(diào)。NRG－1 的合成與表達(dá)受許多神經(jīng)－體液因素影響。有研究表明，在DCM 中，心臟內(nèi)皮素－1 的表達(dá)、氧化應(yīng)激及活性氧產(chǎn)物增加［11］，這些因素可提高內(nèi)皮細(xì)胞NRG－1 的表達(dá)［7，12］。另一方面，DCM 可引起交感神經(jīng)興奮和腎素－血管緊張素系統(tǒng)的激活［1］，去甲腎上腺素和血管緊張素II 分泌增多，二者均可抑制NRG－1 的表達(dá)［6］。同時(shí)，DCM 心臟微血管減少［11］而內(nèi)皮細(xì)胞凋亡增加［13］，造成NRG－1 的來源減少。因此，推測在糖尿病早期，促進(jìn)NRG－1 表達(dá)的因素占優(yōu)勢，心肌組織NRG－1 的表達(dá)并未降低;而在糖尿病晚期，抑制NRG－1 表達(dá)的因素占優(yōu)勢，故心肌組織NRG－1 的表達(dá)顯著下調(diào)。

許多生物學(xué)過程都由NRG1/ErbB 信號系統(tǒng)調(diào)節(jié)，包括細(xì)胞生長、生存、增殖、遷移和分化，細(xì)胞與間質(zhì)的聯(lián)系等［7］。NRG－1/ErbB 系統(tǒng)在成年心臟功能的維護(hù)中扮演著至關(guān)重要的角色。抑制ErbB2/NRG 信號系統(tǒng)可增強(qiáng)紫杉醇對成年大鼠心臟毒性作用，導(dǎo)致心肌纖維化和心功能不全［14］，而外源性NRG－1 可改善缺血性、擴(kuò)張型心肌病及病毒性心肌病模型的心功能，延長存活時(shí)間和減輕病理改變［15］。本研究在誘導(dǎo)糖尿病4 和8 周后，大鼠心肌組織NRG－1 的表達(dá)均未發(fā)生明顯改變，其心功能也處于代償期;而在誘導(dǎo)糖尿病12 周后，伴隨著NRG－1表達(dá)的顯著下調(diào)，大鼠心肌纖維化更明顯，并出現(xiàn)心功能不全的表現(xiàn)，提示NRG－1 表達(dá)減少可能與心肌纖維化及心功能不全的發(fā)生發(fā)展存在著一定聯(lián)系，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

［1］ Belmadani S，Bernal J，Wei CC，et al. A thrombospondin－1 antagonist of transforming growth factor－β activation blocks cardiomyopathy in rats with diabetes and elevated angiotensin II［J］. Am J Pathol，2007，171(3):777－789.

［2］ Connelly KA，Kelly DJ，Zhang Y，et al. Functional，structural and molecular aspects of diastolic heart failure in the diabetic (mRen－2)27 rat［J］. Cardiovasc Res，2007，76(2):280－291.

［3］ Drimal J，Knezl V，Navarova J，et al. Role of inflammatory cytokines and chemoattractants in the rat model of streptozotocin－induced diabetic heart failure［J］. Endocr Requl，2008，42(4):129－135.

［4］ Han B，Baliga R，Huang H，et al. Decreased cardiac expression of vascular endothelial growth factor and redox imbalance in murine diabetic cardiomyopathy［J］. Am J Physiol Heart Circ Physiol，2009，297(2):H829－H835.

［5］ Chen JX，Stinnett A. Disruption of Ang－1/Tie－2 signaling contributes to the impaired myocardial vascular maturation and angiogenesis in type II diabetic mice［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol，2008，28(9):1606－1613.

［6］ Lemmens K，Segers VF，Demolder M，et al. Role of neuregulin－1/ErbB2 signaling in endothelium－cardiomyocyte cross－talk［J］. J Biol Chem，2006，281(28):19469－19477.

［7］ Zhao YY，Sawyer DR，Baliga RR，et al. Neuregulins promote survival and growth of cardiac myocytes. Persistence of ErbB2 and ErbB4 expression in neonatal and adult ventricular myocytes［J］. J Biol Chem，1998，273(17):10261－10269.

［8］ Matteucci E，Giampietro O. Proposal open for discussion:defining agreed diagnostic procedures in experimental diabetes research［J］. J Ethnopharmacol，2008，115(2):163－172.

［9］ 衛(wèi) 峰，寧 光.糖尿病與心血管疾病——基礎(chǔ)和臨床［M］.第1 版.上海:上?？萍冀逃霭嫔?，2006.218－222.

［10］ Ma H，Li SY，Xu P，et al. Advanced glycation endproduct(AGE)accumulation and AGE receptor (RAGE)up－regulation contribute to the onset of diabetic cardiomyopathy［J］. J Cell Mol Med，2009，13(8B):1751－1764.

［11］ Widyantoro B，Emoto N，Nakayama K，et al. Endothelial cell－ derived endothelin－1 promotes cardiac fibrosis in diabetic hearts through stimulation of endothelial－to－mesenchymal transition［J］. Circulation，2010，121(22):2407－2418.

［12］ Kuramochi Y，Cote GM，Guo X，et al. Cardiac endothelial cells regulate reactive oxygen species－induced cardiomyocyte apoptosis through neuregulin－1β/erbB4 signaling［J］. J Biol Chem，2004，279(49):51141－51147.

［13］ Ceriello A，Quagliaro LD，Amico M，et al. Acute hyperglycemia induces nitrotyrosine formation and apoptosis in perfused heart from rat diabetes［J］. Diabetes，2002，51(4):1076－1082.

［14］ Pentassuglia L，Timolati F，Seifriz F，et al. Inhibition of ErbB2/neuregulin signaling augments paclitaxel－induced cardiotoxicity in adult ventricular myocytes［J］. Exp Cell Res，2007，313(8):1588－1601.

［15］ Liu X，Gu X，Li Z，et al. Neuregulin－1/erbB－activation improves cardiac function and survival in models of ischemic，dilated，and viral cardiomyopathy［J］. J Am Coll Cardiol，2006，48(7):1438－1447.