洪冬玲， 吳燕峰， 許呂宏， 方建培△

(中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院 1兒科，2生物治療中心，廣東 廣州 510120)

1000-4718(2012)01-0124-07

2011-04-14

2011-11-02

國家自然科學基金資金資助項目(No. 30872383)

△通訊作者 Tel: 020-81332213; E-mail: jpfang2005@163.com

#現工作單位：廣東省人民醫(yī)院兒科

骨髓間充質干細胞對致敏小鼠造血干/祖細胞移植植入的影響*

洪冬玲1#， 吳燕峰2， 許呂宏1， 方建培1△

(中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院1兒科，2生物治療中心，廣東 廣州 510120)

目的前期的研究已經證實致敏小鼠造血干/祖細胞移植植入失敗率高。本研究擬通過骨髓間充質干細胞(MSCs)進行干預，觀察能否提高造血干、祖細胞移植的植入率。方法應用貼壁培養(yǎng)法體外培養(yǎng)正常小鼠骨髓MSCs，并分為6個實驗組，包括實驗組1：d11 MSCs干預的致敏組；實驗組2： d0 MSCs干預的致敏組；實驗組3：d11和d0 2次MSCs干預的致敏組；實驗組4: 無MSCs干預的致敏小鼠對照組；實驗組5：無MSCs干預的正常小鼠(非致敏小鼠)移植對照組；實驗組6：無MSCs干預的正常小鼠不移植對照組。觀察指標包括生存分析、移植效果分析(血象改變、骨髓細胞恢復及嵌合分析等)和移植物抗宿主病(GVHD)檢測，最終評估MSCs干預對各實驗組異基因造血干/祖細胞移植植入率的影響效果。結果與對照組(實驗組4、5、6)比較，MSCs干預(實驗組1、2、3)在2次異基因脾細胞注射法致敏的動物模型進行異基因造血干/祖細胞移植時，未能促進骨髓造血干/祖細胞移植的植入，也未能延長致敏動物移植后的生存時間。結論體內應用1×106MSCs干預，未能促進2次異基因1×106C57BL/6小鼠脾細胞輸注法建立的重度致敏模型異基因造血干/祖細胞移植的植入。

骨髓間充質干細胞； 致敏小鼠； 造血干/祖細胞移植

不少血液系統(tǒng)的非腫瘤性疾病如重型地中海貧血、重型再生障礙性貧血等均需長期依賴輸血，而造血干細胞移植(hematopoietic stem cell transplantation, HSCT) 是目前臨床上根治此類疾病的唯一方法[1-4]。但移植前接受多次輸血的受者其植入率明顯降低；加用氟達拉濱的清髓預處理雖能徹底殺傷T、B免疫細胞等，也不能清除相關抗體及跨越HLA屏障[5]。如何促進造血干細胞在致敏受者植入是目前全球亟待解決的問題。骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一類具有多向分化潛能的干細胞，并在免疫調節(jié)中發(fā)揮重要作用，已應用于包括嚴重移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)、組織修復工程、器官移植排斥以及自身免疫性疾病等的臨床治療[6]。目前大量實驗結果均說明MSCs在細胞免疫及體液免疫中發(fā)揮重要的免疫調節(jié)作用[7-9]，其免疫調節(jié)作用很大程度由其特定的環(huán)境影響因素決定，在正常小鼠體內主要體現以免疫抑制作用為主，提示應用MSCs可能會降低致敏受者的致敏程度，從而抑制致敏受者對異基因造血干細胞的免疫殺傷作用，有望成為治療致敏受者移植排斥的新策略，但目前國內外均無相關具體的報道，值得進一步探討。我們利用前期實驗中建立的反復異基因脾細胞輸注法致敏的小鼠模型，研究MSCs干預能否促進改善對其造血干/祖細胞移植植入體內外的影響。

材 料 和 方 法

1動物和主要試劑

無特定病原體(SPF級)的C57BL/6(H-2Db)及BALB/c(H-2Dd)小鼠，均為雄性，6～8周，體重18～20 g，由中山大學實驗動物中心提供并飼養(yǎng)。DMEM/F12培養(yǎng)基、10 %優(yōu)質胎牛血清、0.25%胰酶-EDTA購自Gibco；大鼠抗小鼠單克隆抗體anti-CD44-PE、anti-CD105-PE、anti-CD29-PE、anti-Sca-1-FITC、anti-CD34- FITC、anti-CD11b-FITC，anti-H-2Db-FITC、anti-CD3-FITC、anti-CD4-PE、anti-CD8-FITC和anti-CD19-PE 購自Bioscience。甲基纖維素半固體培養(yǎng)基購自Stem Cell。

2正常BALB/c小鼠骨髓MSCs的體外分離、培養(yǎng)及流式檢測[10]

取材于正常BALB/c小鼠股骨和脛骨，制成單細胞懸液后，以DMEM/F12完全培養(yǎng)基(含青、鏈霉素各1×105U/L及胎牛血清10%)培養(yǎng)。48 h 后首次全量換液去除未貼壁細胞,以后每2～3 d 全量換液，大約4～6周。取融合達90%的第4～6代MSCs,以0.25%胰酶/EDTA消化成單細胞懸液，加入熒光標記的抗體anti-CD44-PE、anti-CD105-PE、anti-CD29-PE、anti-Sca-1-FITC、anti-CD34- FITC和anti-CD11b-FITC，應用流式細胞儀分析樣本中細胞相應標記抗原的陽性表達率。

3致敏動物模型的建立

用同種異基因脾細胞輸注法(參照已建立的方法[11])，即經尾靜脈將C57BL/6(H-2Db)小鼠脾淋巴細胞輸注到受者BALB/c小鼠體內使之致敏。具體步驟為：斷頸處死C57BL/6小鼠，75%乙醇浸泡5 min，移到超凈臺上，無菌操作下開腹取脾臟，放入含磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution, PBS)無菌培養(yǎng)皿內，用一次性1 mL注射器抽取PBS反復沖洗到15 mL離心管內，獲取脾細胞；離心沉淀細胞后，用生理鹽水重懸細胞，調細胞計數為1×1010/L;分別于移植前14 d和7 d將1×106(0.1 mL)C57BL/6小鼠脾細胞經尾靜脈輸注到BALB/c小鼠。移植當天定為d0。

4MSCs干預的實驗分組情況

MSCs的量為每只1×106，骨髓造血干/祖細胞的量為每只1×107,每組8只。前3組為采用不同組合的MSCs 干預組; 后3組為不同的對照組。實驗組1：d11應用MSCs干預的致敏移植組；實驗組2：d0應用MSCs干預的致敏移植組；實驗組3：d11及d0共2次應用MSCs干預的致敏移植組；實驗組4：無MSCs干預的致敏移植組；實驗組5：無MSCs干預的正常(非致敏)移植組；實驗組6：無MSCs干預的正常(非致敏)不移植組。

5骨髓移植

以C57BL/6小鼠作為供者，BALB/c小鼠作為受者。移植5 d前開始飲用含抗生素的飲用水(含慶大霉素3.2×105U/L和紅霉素250 mg/L)。移植前4 h予 8 Gy [60Co]照射。分離C57BL/6小鼠股骨及脛骨的骨髓，將細胞濃度調為5×1010/L, 于照射后經尾靜脈注射0.2 mL(1×107) 到上述各組BALB/c小鼠體內。

6移植指標的觀察

6.1生存分析 移植后每天觀察致敏模型的生存狀況，觀察至移植后28 d。記錄死亡時間及繪制生存曲線。

6.2外周血象指標 移植后每周從各組動物尾靜脈采血10 μL，并用KX-21血細胞計數儀(Sysmex)檢測白細胞(white blood cell,WBC)、血紅蛋白(hemoglobin,Hb)和血小板(platelet,PLT)的改變。

6.3骨髓干/祖細胞恢復 移植后每周處死1～3只各組小鼠，分離各組小鼠的股骨，計數每根股骨中骨髓細胞的數量；取2×104骨髓細胞置于1 mL甲基纖維素半固體培養(yǎng)體系進行集落培養(yǎng)，在37 ℃、體積分數5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，計數CFU-GM，以細胞數多于40個為1個集落。

6.4移植后嵌合分析 分離各實驗組小鼠的股骨，取其骨髓細胞經裂解紅細胞后，予FITC標記大鼠抗小鼠H-2Db單抗于4 ℃避光孵育30 min，經PBS洗滌1次，應用FACScan流式細胞儀(Becton Dickinson)檢測供者細胞在受者的嵌合情況。

7統(tǒng)計學處理

結 果

1正常小鼠骨髓MSCs的形態(tài)學觀察

小鼠骨髓細胞接種于塑料培養(yǎng)瓶后, 24 h 后就見有細胞貼壁。48 h后首次全量換液去除未貼壁細胞,此時保留貼壁的細胞，該細胞為單個, 大部分形態(tài)呈圓形，為“原代細胞”。原代細胞培養(yǎng)3～4周左右,細胞開始快速增殖,每個集落中的細胞不斷增殖呈“漩渦狀”,再培養(yǎng)2～3周左右,每個小集落形成數百至上千個細胞的大集落,集落交界處出現重疊、融合。經胰酶消化后的MSCs呈圓形,胞體較大,傳代24 h 內完全貼壁伸展,呈成纖維細胞樣形態(tài),傳代后的MSCs形態(tài)逐漸單一。圖1A、B分別為正常小鼠骨髓MSCs原代和第4代的細胞形態(tài)圖。

Figure 1. Morphology of normal mouse bone marrow-derived MSCs(×50). A：primary;B:the forth passage.

圖1正常小鼠骨髓源性MSCs的形態(tài)

2正常小鼠MSCs表面標志的流式檢測

正常小鼠骨髓MSCs隨著細胞傳代數的增加，從第4代的MSCs開始已經表達較典型的MSCs流式標志：CD29+、CD44+、 CD105+、Sca-1+、CD34-和CD11b-,見圖2。

Figure 2. Expression of the surface markers,CD29，CD44, CD105, Sca-1,CD34 and CD11b, in the mouse bone marrow-derived MSCs at passage 4.

圖2小鼠骨髓MSCs第4代的表面標志CD29、CD44、CD105、Sca-1、CD34和CD11b的表達

3生存分析

如圖3及表1顯示經8 Gy [60Co]照射后，各實驗組動物的生存情況。

其中致敏組(包括實驗組1、2、3和4)與正常(非致敏)移植對照組(實驗組5)間的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，與正常(非致敏)不移植空白對照組(實驗組6)間的差異也有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。正常(非致敏)移植對照組(實驗組5)說明在正常狀態(tài)下的異基因造血干/祖細胞移植是成功的；而正常(非致敏)不移植空白對照組(實驗組6)全部死亡，說明移植前予[60Co]照射是致死性；但與無MSCs干預(實驗組4)相比，MSCs干預(實驗組1、2和3)均未能促進致敏小鼠異基因造血干/祖細胞移植的植入(P>0.05)。

Figure 3. Survival cures of mice in Group 1～6.n=8.

圖3各組動物的生存曲線

表1 各實驗組的生存時間

4造血重建

4.1外周血象恢復 MSCs干預的致敏移植組(實驗組1、2、3)與無MSCs干預的致敏移植組(實驗組4)比較，在移植第1周WBC和PLT改變的兩兩比較中均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而Hb比較卻P>0.05。移植后第2周發(fā)現，WBC、PLT和Hb差異卻均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；而不同的 MSCs干預組之間(實驗組1、2和3)兩兩比較都未發(fā)現差異有統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖4。

Figure 4. Blood recovery of mice in Group 1～6. A:hemoglobin(Hb);B:white blood cell(WBC)；C:platelet(PLT).

圖4各實驗組移植后的血象結果

4.2移植后骨髓細胞的數量 表2顯示各實驗組受者骨髓細胞恢復情況。其中致敏組(實驗組1、2、3和4)與非致敏組(實驗組5和6)比較：第1周時致敏組與非致敏組中的移植組(實驗組5)的比較中發(fā)現其差異無統(tǒng)計學意義(n=8,P>0.05)，而與非致敏組中的不移植組(實驗組6)的比較差異均有統(tǒng)計學意義(n=8,P<0.05)；在移植后第2周時，致敏組1、2、3及4與非致敏移植實驗組5差異均有統(tǒng)計學意義(n=8,P<0.01)，說明致敏組骨髓被排斥，而非致敏移植組骨髓正在恢復。

表2受者骨髓細胞恢復情況

Groupd7d14d21d281203±21 55±5 2243±6057±153223±2156±214213±2560±205236±41513±15713±31833±616 41±8

4.3移植后恢復的骨髓細胞粒-巨噬細胞集落刺激單位(colony-forming unit-granulocyte macrophase,CFU-GM)功能檢測

4.3.1非致敏組 單純放射不移植組(實驗組6)因致死性放射后骨髓衰竭，無CFU-GM細胞集落生成；正常移植組(實驗5)第1及第2周的CFU-GM細胞集落分別為49.00±6.65和80.00±8.00，后者與同期正常小鼠(95.0±6.4)比較P>0.05，無統(tǒng)計學意義，說明正常移植組的造血干/祖細胞移植成功，骨髓細胞功能在進行性恢復。

4.3.2致敏組 無MSCs干預的致敏移植組(實驗組4)與有MSCs干預的實驗組(1、2及3)移植后的第1周CFU-GM數量分別為25.67±6.66、24.00±5.29、25.33±4.16及23.33±4.26，它們之間的兩兩比較差異均無統(tǒng)計學意義；但與正常小鼠照射移植組(實驗組5)兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；說明致敏小鼠移植組無論MSCs干預與否，第1周骨髓雖然有植入但其功能是有缺陷的。而第2周無論是實驗4或1、2及3組均未見CFU-GM細胞集落生成，而相對應同期出現了免疫排斥、小鼠移植失敗死亡的表現，見圖5。

Figure 5. Colony-forming unit-granulocyte macrophage clonogenicity(×50).A:experimental group 3 (sensitized mice with MSC intervention);B:group 4 (sensitized mice without MSC intervention);C:group 5 (normal transplantion).

圖5CFU-GM細胞集落

5移植后H-2Db嵌合分析

移植后第1周無論是致敏小鼠(包括MSCs干預或未干預的)和正常小鼠組骨髓細胞中均部分呈現供者來源的H-2Db陽性細胞，但程度稍有不同，其中致敏小鼠部分：實驗組1、2、3及4分別為(38.15±4.80)%、(44.05±7.93)%、(50.16±1.98)%及(43.64±5.82)%，組間進行兩兩比較差異無統(tǒng)計學意義。但與同期非致敏部分[實驗組5,(61.76±5.82)%]比較，差異有統(tǒng)計學意義。但在第2周正常小鼠組(實驗組5)供者來源的H-2Db陽性細胞明顯增多，為(90.97±6.47)%，說明骨髓在恢復，而致敏組[包括MSCs干預組(實驗組1、2、3)和非MSCs干預組(實驗組4)]均因骨髓細胞數過少，而沒能進行H-2Db的檢測，說明供者源性骨髓細胞受到排斥，MSCs的干預未能促進致敏小鼠異基因移植的植入和減少GVHD發(fā)生，未能延長致敏受者移植后的生存時間。

討 論

有研究表明[12-14]： MSCs既可通過抑制T淋巴細胞的增殖，從而降低致敏過程中的細胞免疫反應，又可通過抑制B淋巴細胞分泌的抗體從而抑制體液免疫。雖然已有不少研究表明移植后輸注MSCs可促進造血恢復及降低GVHD的發(fā)生，但MSCs于移植前干預是否可能降低致敏程度，促進其移植植入卻有待探討。在我們的體內活體實驗中，于d11和(或)d0進行MSCs干預的實驗結果表明：此策略不能延長致敏受者的生存時間。而進一步具體分析表明，移植后第1周無論MSCs干預與否，骨髓H-2Db檢測結果發(fā)現，致敏小鼠的異基因骨髓均有短暫植入；但MSCs干預組血象中WBC、Hb及PLT的下降程度比無MSCs干預的致敏組低；到了第2周，無論是否進行過MSCs干預，致敏小鼠均出現明顯貧血、脫毛及腹瀉等，可能是GVHD，也可能是移植預處理的毒副作用；但隨后的骨髓H-2Db檢測證明移植物已被排斥，移植失敗，不能造血重建，最終很快死亡。MSCs的干預未能促進致敏受者骨髓移植的植入。而Sudres等[15]報道在正常小鼠移植GVHD模型中，MSCs能在體外很好抑制致敏動物的淋巴細胞增殖，但在體內實驗中卻未能降低GVHD的發(fā)生，促進造血干/祖細胞移植的植入；其它報道亦認為雖然MSCs在體外對淋巴細胞的免疫調節(jié)作用以抑制為主，但到了體內該作用卻喪失了，未出現促進造血干細胞移植的效果[13，16]。其原因如何？值得深入探討。

而我們推測與如下原因有關：(1)可能與致敏模型即異基因脾細胞致敏的嚴重程度和所應用的MSCs劑量有關。我們采用的是1×106共2次(重度致敏)的致敏動物模型進行干預，同時已證實該種致敏程度下的移植100%是失敗的。這本身僅僅代表臨床情況的一種；臨床實踐工作中我們發(fā)現雖然致敏受者的移植成功率雖較非致敏受者低，但并非為0%。100%失敗率的致敏模型足以證明其致敏程度是重度的，已經涉及到免疫記憶細胞等多方面因素，可能非單一干預手段所能解決。因此我們在今后的研究中提出分層干預理念，即：MSCs的干預應視致敏程度而有所不同，可進一步將致敏分為輕、中、重度和MSCs劑量分為低、中、高進行研究。(2)我們必須注意到體內MSCs與體外MSCs在表型及功能方面是有差別的，體外培養(yǎng)時往往是MSCs某一亞群得以優(yōu)勢生長增殖，而同一克隆的MSCs在生長過程中其基因表達、增殖能力、分化潛能及免疫表型也稍有差別，這說明MSCs體內和體外功能等方面可能是有差異的，這與MSCs狀態(tài)、微環(huán)境具體情況密切相關[17-19]。(3)MSCs畢竟是成體干細胞，體積偏大，進入活體體內的數量有限，否則容易導致動物肺栓塞死亡等危險。(4)致敏程度與MSCs比例問題值得進一步探討。本研究結果基本證實了對2次應用1×106異基因脾細胞致敏的小鼠動物模型來說，在這樣的重度致敏程度下，于d11和(或)d0應用1×106MSCs對其造血干/祖細胞的移植的干預是不能起到促進其植入作用的，但該致敏程度與所用MSCs比例是否合適，有待進一步探討。(5)與致敏機制密切相關。我們模擬臨床上反復輸血患者的致敏情況，應用異基因脾細胞進行動物致敏，研究表明主要是T、B淋巴細胞參與，涉及體液免疫及細胞免疫，而MSCs可以對T或B細胞的增殖起到抑制作用，但在實際致敏過程中可能涉及到記憶性T或B細胞等多種免疫細胞及多種因子的參與。MSCs的作用如何，以及MSCs進入致敏動物體內后如何受到致敏動物體內相關因子的“干預或引導”等也有待進一步研究。無論如何MSCs體現出的強大免疫調節(jié)作用及其低免疫原性，應用的安全性不容質疑，但需在策略方面例如分層干預等方面進一步探討。

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Effectofbonemarrowmesenchymalstemcellsonengraftmentofhematopoieticstem/progenitorcellsinsensitizedmice

HONG Dong-ling1, WU Yan-feng2, XU Lü-hong1, FANG Jian-pei1

(1DepartmentofPediatrics,2BiotherapyCenter,SunYat-senMemoryHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China.E-mail:jpfang2005@163.com)

AIM: To evaluate the effects of bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) on engraftment of hematopoietic stem/progenitor cells in sensitized mice.METHODSMouse bone marrow-derived MSCs were cultured by adherent culture method. MSCs combined with or without hematopoietic stem/progenitor cells were implanted into the sensitized mouse model, which was established by allogeneic splenocyte transfusion, and were divided into 6 groups: MSC intervention groups, including sensitized mice with MSCs on day 11, sensitized mice with MSCs on day 0 and sensitized-mice with MSCs both on day 11 and day 0; control groups, including sensitized mice without MSC intervention, non-sensitized mice without MSC intervention and non-sensitized mice without MSCs or transplantation of hematopoietic stem/progenitor cells. The survivors were assessed after transplantation and hematopoietic recovery was monitored weekly including hematological change, immune function reconstruction, bone marrow cell recovery, chimera analysis and graft-versus-host disease development.RESULTSCompared with different control groups, MSC intervention did not prolong the survival rates of the sensitized model mice after lethal irradiation.CONCLUSIONUnder the experimental conditions, MSC combined with C57BL/6 bone marrow hematopoietic stem/progenitor cells fail to promote the growth of engraftment in C57BL/6 allogeneic splenocyte-sensitized BALB/c miceinvivo.

Bone marrow mesenchymal stem cells; Sensitized mice; Hematopoietic stem/progenitor cell transplantation

R457

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.01.024