楊孟雪， 甘 華△， 沈 清， 湯為學(xué)

(1 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科，2 重慶市神經(jīng)病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶400016)

越來(lái)越多的研究表明，糖尿病患者體內(nèi)存在細(xì)胞因子介導(dǎo)的慢性低度炎癥反應(yīng)狀態(tài)。非特異性免疫系統(tǒng)激活參與2 型糖尿病(type 2 diabetic mellitus，T2DM)及其并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展其作用途徑包括遺傳變異、單核/巨噬細(xì)胞的促炎作用、慢性感染、Toll樣受體(Toll－like receptor，TLR)途徑、巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)水平增高等。CD14+CD16+單核細(xì)胞被認(rèn)為是促炎性單核細(xì)胞亞群［1－2］。T2DM 慢性低度炎癥時(shí)CD14+CD16+表達(dá)情況如何，少有報(bào)道。本研究的目的是探討T2DM 患者體內(nèi)CD14+CD16+單核細(xì)胞的比例及其對(duì)脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)和白細(xì)胞介素15(interleukin－15，IL－15)刺激的反應(yīng)，以了解炎癥性免疫反應(yīng)在T2DM 中的可能作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 研究對(duì)象

收集2009 年5 月～2011 年5 月正常對(duì)照組20例，男性10 例，女性10 例，平均年齡(49 ±6)歲，均為健康志愿者，經(jīng)檢查體格健康，并排除糖尿病、高血壓、冠心病及腎病等內(nèi)分泌代謝性疾病病史，均無(wú)糖尿病家族史。同時(shí)收集2009 年5 月～2011 年5月重慶醫(yī)科大學(xué)腎內(nèi)科及內(nèi)分泌科T2DM 患者28例，男性15 例，女性13 例，平均年齡(52 ±8)歲，病程(4.4 ±1.9)年。糖尿病診斷均符合1999 年世界衛(wèi)生組織(WHO)糖尿病診斷和分型標(biāo)準(zhǔn)。且符合以上標(biāo)準(zhǔn)的2 型糖尿病患者谷氨酸脫羧酶抗體(glutamic acid decarboxylase antibody，GADA)水平＜1.0，25－羥維生素D3［25(OH)D3］水平= 21 ～29 μg/L，空腹血糖低于7.0 mmoL/L，糖化血紅蛋白(hemoglobin A1c，HbA1c)低于6.5%納入。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)1型及繼發(fā)性糖尿病;(2)急性感染性疾病;(3)心、肝功能不良;(4)近3 個(gè)月發(fā)生過(guò)糖尿病急性并發(fā)癥及感染;(5)妊娠、哺乳;(6)其它腎病、結(jié)締組織病和自身免疫性疾病;(7)腫瘤、心腦血管意外、哮喘、使用對(duì)研究有影響的藥物等。所有入選者(表1)為中國(guó)漢族彼此間無(wú)親緣關(guān)系的人群。本研究獲得患者本人同意及重慶醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

表1 2 組入選者的基線特征Table 1. Subject characteristics at baseline(±s)

表1 2 組入選者的基線特征Table 1. Subject characteristics at baseline(±s)

BMI:body mass index;HBA1c:hemoglobin A1c;LDL:low－ density lipoprotein;HDL:high－density lipoprotein;BP:blood pressure;BUN:blood urea nitrogen;SCr:serum creatinine;WBC:white blood cell;CRP:C－reactive protein;IL－6:interleukin－6;25(OH)D3:25－h(huán)ydroxyvitamin D3. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs healthy subjects.

Index Healthy subjects(n=20) T2DM patients(n=28)49±6 52±8 Male/female 10/10 15/13 Diabetes duration(year) 4.4±1.9 BMI(kg/m2) 23.1±1.9 22.4±3.1 HbA1c(%) 5.6±0.5 5.8±0.6 Fasting glucose(mmol/L) 5.5±0.9 5.9±0.8 Triglyceride(mmol/L) 1.6±0.5 1.9±0.7 Total cholesterol(mmol/L) 4.2±0.6 4.2±0.8 LDL－cholesterol(mmol/L) 2.6±0.6 2.2±0.6*HDL－ cholesterol(mmol/L) 1.2±0.5 1.1±0.2 Systolic BP(mmHg) 134±6 136±9 Diastolic BP(mmHg) 76±9 76±8 BUN(mmol/L) 5.6±0.7 5.7±1.5 SCr(μmol/L) 69.0±9.1 68.1±14.6 WBC(×109/L) 5.9±0.7 5.4±1.4 Neutrophils(×109/L) 3.0±0.4 2.9±0.6 Monocytes(×109/L) 0.3±0.1 0.3±0.1 CRP(mg/L) 1.7±0.7 3.3±1.6＊＊IL－6(ng/L) 11.0±2.0 55.5±17.1＊＊25(OH)D3(μg/L) 45.7±7.8 25.1±2.5 Age(year)＊＊

2 主要試劑

RPMI－1640 培養(yǎng)基、胎牛血清均購(gòu)自Gibco，人淋巴細(xì)胞分離液1.077 及LPS 均購(gòu)自Sigma，重組人IL－15 購(gòu)自PeproTech。藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)標(biāo)記的抗人分化群(cluster of differentiation，CD)14 和異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記的抗人TLR4 抗體均購(gòu)自AbD Serotec，鼠單克隆信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子5(signal transducer and activator of transcription 5，STAT5)和磷酸化STAT5(phosphorylated STAT5，p－STAT5)抗體均購(gòu)自Santa Cruz。羊抗小鼠β－actin 抗體購(gòu)自北京四正柏公司。山羊抗小鼠和兔抗山羊Ⅱ抗均購(gòu)自北京中杉金橋公司，IL－6 和單核細(xì)胞趨化蛋白－1(monocyte chemotactic protein－1，MCP－1)的ELISA 檢測(cè)試劑盒由Biosource 提供。25 (OH)D3的ELISA 檢測(cè)試劑盒由R＆D 提供。GADA 測(cè)定:采用BioMerica試劑盒，用酶聯(lián)免疫法測(cè)定。HbA1c 測(cè)定:采用化學(xué)發(fā)光法，應(yīng)用Diastar 糖化血紅蛋白分析儀檢測(cè)。血常規(guī)應(yīng)用XE－2100 全自動(dòng)分析儀檢測(cè)?？崭寡?、血脂、腎功能及高敏C 反應(yīng)蛋白(high－sensitive C－reative protein，hsCRP)的測(cè)定:空腹抽取靜脈血，采用奧林巴斯全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)。

3 主要方法

3.1 血標(biāo)本的采集及外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)的分離和培養(yǎng) 采集研究對(duì)象晨起空腹靜脈血，低溫離心，取血清，置－80 ℃冰箱保存待用。剩余靜脈血置于肝素抗凝的試管中，用于流式檢測(cè)及PBMCs 的分離。Ficoll 淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心分離出外周血PBMCs，加入完全RPMl－1640 培養(yǎng)基(含10%的熱失活胎牛血清，青霉素及鏈霉素各1 ×106U/L)制成細(xì)胞懸液，混勻后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)及臺(tái)盼藍(lán)鑒定細(xì)胞活力(至少＞95%)。調(diào)整細(xì)胞濃度為2 ×108/L 接種至24孔板然后置于37 ℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.2 實(shí)驗(yàn)分組 分離外周血單個(gè)核細(xì)胞接種培養(yǎng)于24 孔板中，RPMl－l640 培養(yǎng)基(含10%的熱失活胎牛血清、青霉素及鏈霉素各1 ×106U/L)培養(yǎng)24 h后每組均加入1 mg/L LPS 和100 μg/L 重組人IL－15 干預(yù)4 h(每個(gè)樣本做2 個(gè)復(fù)孔):(1)健康對(duì)照組(n=20);(2)T2DM 組(n =28)。LPS 聯(lián)合IL－15干預(yù)4 h 后收集PBMC 和培養(yǎng)液。LPS 和IL－15 的濃度選擇參照預(yù)實(shí)驗(yàn)和文獻(xiàn)［3－4］。

3.3 流式檢測(cè)CD14+CD16+單核細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度值(mean fluorescence intensity，MFI) 取EDTA 抗凝的外周全血150 μL 加入流式管底，預(yù)留1 管作為空白對(duì)照管，不加熒光抗體，其余各管分別加入相應(yīng)的抗體(CD14－PE 和CD16－FITC 各10 μL)，振蕩混勻后避光，室溫孵育;在上述液體內(nèi)分別加入紅細(xì)胞裂解液;然后洗滌細(xì)胞;每管內(nèi)加入多聚甲醛固定;流式細(xì)胞儀上檢測(cè)CD14+CD16+的MFI。同時(shí)使用同型對(duì)照使其能夠有效確?？贵w的特異性。

3.4 Western blotting 檢測(cè)STAT5 和p－STAT5 蛋白表達(dá) 冰上裂解細(xì)胞，BCA 法測(cè)定蛋白濃度?？偟鞍咨蠘佑?2%SDS－PAGE 電泳分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，以含5%脫脂奶粉的TBST 封閉后，分別加入小鼠抗人STAT5 抗體和小鼠抗人p－STAT5 抗體及羊抗小鼠β－actin 抗體，4 ℃過(guò)夜，洗膜，分別加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠和兔抗山羊IgG 孵育，掃描儀成像，自動(dòng)成像系統(tǒng)分析。

3.5 熒光顯微鏡下觀察單個(gè)核細(xì)胞p－STAT5 蛋白表達(dá) 干預(yù)前和干預(yù)結(jié)束后，PBS 清洗細(xì)胞，4%多聚甲醛固定，牛血清封閉，0.3%Triton X－100 透膜處理5 min，1∶200Ⅰ抗(小鼠抗人p－STAT5 抗體)4 ℃孵育過(guò)夜，1∶50 熒光Ⅱ抗(FITC 標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG)孵育1 h，DAPI 孵育10 min，熒光顯微鏡攝像。

3.6 細(xì)胞因子檢測(cè) ELISA 法檢測(cè)外周血和上清液IL－6 及MCP－1 的濃度，按照ELISA 試劑盒操作說(shuō)明操作，IL－6 和MCP－1 含量計(jì)算結(jié)果以ng/L表示。試劑的批內(nèi)分析和批間分析變異系數(shù)均＜10%，所有樣本設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(± s)表示，兩個(gè)連續(xù)變量的關(guān)系作Spearman's 相關(guān)分析，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 病人的基線特征

2 組間年齡、性別、體重指數(shù)、HbA1c、空腹血糖、血壓、腎功能、甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白、外周血白細(xì)胞和單核細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)無(wú)顯著差異(P ＞0.05);T2DM 患者外周血低密度脂蛋白、25(OH)D3、IL－6 及hsCRP 水平高于正常對(duì)照人群(P ＜0.01)，見(jiàn)表1。

2 CD14+CD16+單核細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度

如圖1 所示，T2DM 組的CD14+CD16+單核細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度值顯著高于正常對(duì)照組(T2DM組6.9 ±2.3;正常對(duì)照組4.6 ±1.5)，P ＜0.01。

3 LPS 和IL－15 干預(yù)后STAT5 和p－STAT5 蛋白的表達(dá)

LPS 和IL－15 干預(yù)4 h，T2DM 組PBMC p－STAT5 蛋白水平表達(dá)上調(diào)，與正常對(duì)照組比較，差異顯著(T2DM 組0.37 ±0.08，正常對(duì)照組0.12 ±0.04，P ＜0.05)。但STAT5 總蛋白表達(dá)2 組比較沒(méi)有明顯差異(P ＞0.05)，見(jiàn)圖2。

4 LPS 和IL－15 干預(yù)前后PBMC 中p－STAT5蛋白表達(dá)的變化

LPS 和IL－15 干預(yù)前T2DM 患者PBMC 核內(nèi)不表達(dá)p－STAT5，經(jīng)過(guò)LPS 聯(lián)合IL－15 干預(yù)后T2DM患者細(xì)胞核內(nèi)有p－STAT5 的表達(dá)，提示p－STAT5處于激活狀態(tài)，但健康對(duì)照組LPS 與IL－15 干預(yù)前后細(xì)胞核內(nèi)均無(wú)p－STAT5 表達(dá)，見(jiàn)圖3。

Figure 1. MFI of CD14 +CD16 + expression in monocytes from the two groups. A:healthy subjects;B:type 2 diabetes (T2DM)patients.a:identification of monocytes displayed in a representative FSC/SSC dot plot;b:flow cytometry analysis of isotypematched control antibody;c:a representative flow cytometry chart of CD16 expression by CD14－positive monocytes. MFI of CD14 +CD16 + =c/b.圖1 2 組CD14 +CD16 +單核細(xì)胞MFI 的表達(dá)

Figure 2. The expression of STAT5 and p－STAT5 protein in LPS－ and IL－15－treated PBMC. 1:healthy subjects;2:T2DM patients.圖2 LPS 和IL－15 干預(yù)后PBMC STAT5 和p－STAT5 的表達(dá)

5 LPS 和IL－15 干預(yù)后PBMC 培養(yǎng)上清液中IL－6 和MCP－1 水平

LPS 和IL－15 干預(yù)后，T2DM 組PBMC IL－6 和MCP－1 水平均明顯高于正常對(duì)照組(P ＜0.01)，見(jiàn)表2。

6 相關(guān)分析

T2DM 組外周血CD14+CD16+單核細(xì)胞數(shù)量明顯高于正常對(duì)照組(P ＜0.01)，并與血清CRP 和IL－6水平呈正相關(guān)(r=0.394，P ＜0.05 和r=0.741，P ＜0.01)，與25(OH)D3濃度呈負(fù)相關(guān)(r =－0. 409，P ＜0.01)，且25(OH)D3水平與CRP 和IL－6 水平呈負(fù)相關(guān)(r=－0.479 和r=－0.774，均P ＜0.01)。

表2 LPS 和IL－15 干預(yù)后PBMC 培養(yǎng)上清中IL－6 和MCP－1 水平Table 2. The cell supernatant IL－6 and MCP－1 levels in LPS－and IL－15－treated PBMC from the two groups(ng/L. ±s)

表2 LPS 和IL－15 干預(yù)后PBMC 培養(yǎng)上清中IL－6 和MCP－1 水平Table 2. The cell supernatant IL－6 and MCP－1 levels in LPS－and IL－15－treated PBMC from the two groups(ng/L. ±s)

* P ＜0.05 vs healthy subjects.

Group n IL－6 MCP－1 Healthy subjects 20 20.3 ±8.5 18.9 ±8.2 T2DM pratients 28 49.6 ±13.5* 29.1 ±10.4*

討 論

最近的一些相關(guān)研究［5－7］表明單核/巨噬細(xì)胞、炎癥可能與T2DM 及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展存在密切關(guān)系。在過(guò)去幾年，多項(xiàng)研究［8－10］已經(jīng)顯示T2DM、炎癥與維生素D 缺乏癥間存在聯(lián)系。維生素D 與糖尿病之間的相關(guān)性研究是一個(gè)新的研究領(lǐng)域。自從在胰島B 細(xì)胞和免疫細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)維生素D 受體后，越來(lái)越多的證據(jù)表明維生素D 缺乏的個(gè)體更易患糖尿病。流行病學(xué)研究顯示，生命早期的維生素D 缺乏與將來(lái)1 型糖尿病的發(fā)病存在聯(lián)系，而補(bǔ)充維生素D 可以預(yù)防1 型糖尿病，改善2 型糖尿病的血糖控制。

Figure 3. Expression of p－STAT5 in LPS－and IL－15－treated PBMC.A:p－STAT5 expression in PBMC from T2DM group before LPS and IL－15 treatment;B:p－STAT5 expression in PBMC from T2DM group after LPS and IL－15 treatment.a:FITClabeled p－STAT5 ;b:DAPI－labeled nucelus;c:merged.圖3 LPS+IL－15 對(duì)p－STAT5 在PBMC 中表達(dá)的影響

對(duì)T2DM 動(dòng)物模型ob/ob 大鼠的研究證實(shí)，維生素D 缺乏時(shí)胰島素的分泌被抑制，補(bǔ)充維生素D 以后，胰島素水平增加，血糖水平下降［11］。另有研究顯示，1，25－(OH)2D3可以顯著下調(diào)T2DM 患者單核細(xì)胞中TNF－α、IL－6、IL－l 和IL－8 的表達(dá)，從而證明1，25－(OH)2D3可以調(diào)節(jié)T2DM 患者單核細(xì)胞的炎性反應(yīng)狀態(tài)［12］。

DM 的相關(guān)體外研究發(fā)現(xiàn)，來(lái)自1 型DM(T1DM)和T2DM 的單核細(xì)胞具有促炎特性，表達(dá)炎癥因子的能力增強(qiáng)［13－14］。本研究結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，T2DM 組外周血CD14+CD16+單核細(xì)胞熒光強(qiáng)度值與CRP 和IL－6 水平呈正相關(guān)，與25(OH)D3濃度呈負(fù)相關(guān)，且25(OH)D3水平與CRP和IL－6 水平均呈負(fù)相關(guān)。IL－15 和LPS 刺激后，檢測(cè)T2DM 患者PBMC 培養(yǎng)上清IL－6 和MCP－1水平，均高于正常對(duì)照組，CD14+CD16+單核細(xì)胞被認(rèn)為是促炎性單核細(xì)胞亞群，這表明CD14+CD16+單核細(xì)胞的異常表達(dá)可能與T2DM 的微炎癥狀態(tài)相關(guān)，這一微炎癥狀態(tài)可能與患者體內(nèi)維生素D 不足有關(guān)。

IL－15 是1994 年由Grabstein 發(fā)現(xiàn)的可溶性細(xì)胞因子，它分布較廣泛，尤其在單核/巨噬細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)最多。IL－15 在很小劑量(10 μg/L)即能誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生改變，呈典型的活化細(xì)胞形態(tài)，從而證明IL－15 能夠啟動(dòng)細(xì)胞骨架的重排［15－16］。Alleva 等［17］的研究表明，IL－15 作為一種單核因子通過(guò)自分泌的方式作用于單核巨噬細(xì)胞，而且單核巨噬細(xì)胞對(duì)IL－15 的劑量變化非常敏感。高濃度的IL－15(10 ～1 000 μg/L)能增加LPS 活化的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎(proinflammatory)因子(如IL－1、IL－6 和TNF－α)，而低濃度的IL－15(＜1.0 μg/L)能選擇性地抑制促炎因子的產(chǎn)生。

STAT5 是胞漿中潛在的轉(zhuǎn)錄因子。在無(wú)刺激情況下，細(xì)胞內(nèi)無(wú)p－STAT5 表達(dá);在細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子等外界信號(hào)分子的刺激下，STAT5 發(fā)生磷酸化和二聚化進(jìn)入細(xì)胞核，結(jié)合在基因特定的啟動(dòng)子上調(diào)控轉(zhuǎn)錄。IL－6、IL－15 等細(xì)胞因子與細(xì)胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合后，可立即激活胞質(zhì)內(nèi)與受體偶聯(lián)的Janus 激酶(Janus kinase，JAK)，繼而迅速引起STAT5的酪氨酸磷酸化，啟動(dòng)下游的一系列效應(yīng)［18］。

本研究以IL－15 和LPS 為外界信號(hào)分子刺激單核細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)LPS 和IL－15 干預(yù)4 h，與正常對(duì)照組相比，T2DM 組單核細(xì)胞p－STAT5 蛋白表達(dá)上調(diào)，且IL－6 和MCP－1 水平均明顯高于正常對(duì)照組。本研究還發(fā)現(xiàn)T2DM 患者單核細(xì)胞STAT5 分子在IL－15 和LPS 刺激前無(wú)胞核分布，刺激后發(fā)生磷酸化聚集于胞核中，可能是由于構(gòu)象的改變暴露了核定位序列形成同源或異源二聚體，而促進(jìn)磷酸化的STAT5 入核，從而參與單核細(xì)胞趨化因子和炎癥因子等的合成和分泌的調(diào)節(jié)。而正常對(duì)照人群LPS和IL－15 干預(yù)前后改變差異不明顯。本研究得出的結(jié)果與Hormann 等［19］的類(lèi)似。

本研究顯示IL－15 和LPS 可能是PBMC 釋放炎癥因子和趨化因子的重要刺激因素，IL－15 和LPS 通過(guò)增加PBMC 內(nèi)IL－6 和MCP－1 的生成，激活p－STAT5 信號(hào)通路從而參與并放大了動(dòng)脈粥樣硬化炎癥免疫反應(yīng)，這可能是糖尿病患者易患冠心病、糖尿病腎病等動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的重要原因之一。

以上結(jié)果提示在T2DM 患者體內(nèi)可能存在單核細(xì)胞功能紊亂，這種功能紊亂可能與活性維生素D3不足有關(guān)，二者可能參與了T2DM 患者體內(nèi)免疫炎癥反應(yīng)并與微炎癥互為因果，從而導(dǎo)致了T2DM 及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展。其作用機(jī)制可能與STAT5 信號(hào)通路的激活有關(guān)。因此，后續(xù)工作我們將針對(duì)性地對(duì)以上途徑進(jìn)行研究，深入探討T2DM 患者單核細(xì)胞與微炎癥的關(guān)系，及炎癥調(diào)節(jié)的機(jī)制，以便為T(mén)2DM 及其并發(fā)癥的預(yù)防和改善提供新線索。

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