青蒿琥酯通過抑制ERK1/2 蛋白活化負性調(diào)控HSC－T6 細胞cyclin D1 的表達和AP－1 活性*

來麗娜， 宋曉亮， 任澤恩， 楊柳絮， 王黎敏， 鄭王巧， 郭春花， 張曉一

(長治醫(yī)學院1藥理教研室，3 肝病研究所，4 機能實驗室，2 長治市第二人民醫(yī)院，山西 長治046000)

肝纖維化是所有慢性肝病共有的病理特征，是向肝硬化發(fā)展的必經(jīng)階段，在此過程中肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSCs)的激活是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)。目前臨床仍沒有療效好、不良反應(yīng)少的抗肝纖維化藥物。我國中藥資源豐富，從天然藥物中發(fā)掘抗肝纖維化藥物具有廣闊的前景。青蒿琥酯(artesunate，Art)是青蒿素水溶性衍生物，前期實驗表明Art 對四氯化碳(carbon tetrachloride，CCL4)導致的大鼠肝纖維化模型和牛血清白蛋白導致的大鼠肝纖維化模型有防治作用［1－2］，且體外可抑制HSC－T6 細胞的增殖，阻止其從G0/G1期進入S期［3］。本實驗用血小板源性生長因子BB(platelet－derived growth factor BB，PDGF－BB)刺激HSC－T6細胞，觀察不同濃度的Art 對HSCs 增殖信號分子的影響，進一步探討Art 抗肝纖維化作用的分子機制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 試劑 Art(原料藥，廣西桂林制藥二廠);RNAiso Plus 抽提試劑(TaKaRa)，DL2000 DNA marker(TaKaRa)，RNA PCR Kit(AMV)3.0(TaKaRa)，Western blotting 細胞裂解液(碧云天生物技術(shù)研究所)，BCA 蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)，大鼠Ⅰ型膠原ELISA 試劑盒(上海時代科技發(fā)展有限公司)，Western Blue? anti－mouse IgG(Promega)，小鼠來源甘油醛－3－磷酸脫氫酶(glyceraldehyde 3－phosphate dehydrogenase，GAPDH)Ⅰ抗(碧云天生物技術(shù)研究所)，小鼠來源cyclin D1 Ⅰ抗(Santa Cruz)。磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(phosphorylated extracellular signal－regulated kinase，p－ERK)單克隆抗體和ERK 特異性阻斷劑PD98059 均購自Promega。PDGF－BB(PeproTech)，EMSA/Gel－Shift 試劑盒和EMSA 用AP－1 探針購自碧云天生物技術(shù)研究所;核蛋白提取試劑盒購自Active Motif，［γ－32P］ATP 購自北京亞輝生物醫(yī)學工程公司，PCR 引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2 儀器 CL31R 低溫超速離心機(Thermo)，核酸蛋白分析儀(Bio－Rad)，S1000PCR 擴增儀(Bio－Rad)，凝膠成像分析系統(tǒng)(Alpha Innotech)，MK3 酶標儀(Thermo);IX70 倒置顯微鏡(奧林巴斯)，CO2恒溫培養(yǎng)箱(NuAire)，SW－CJ－ZFD 超凈工作臺(中國安泰公司)。

2 方法

2.1 HSC－T6 細胞的培養(yǎng)及實驗分組 HSC－T6細胞株由長治醫(yī)學院肝病研究所趙中夫教授惠贈，用DMEM 常規(guī)培養(yǎng)。將指數(shù)生長期的細胞按1 ×109/L 密度接種。待細胞鋪滿約70%時，換無血清的DMEM 培養(yǎng)6 h，而后分為6 組:對照組;PDGF－BB 組(終濃度60 μg/L);PDGF－BB +Art 組(用60 μg/L PDGF－BB 預處理30 min 后再加入6.25 mg/L、25 mg/L 和50 mg/L Art)，PDGF－BB +PD98059組(用60 μg/L PDGF－BB 預處理30 min 后再加入終濃度為100 μmol/L PD98059)，藥物作用24 h。

2.2 ELISA 法測定HSCs 培養(yǎng)上清液中Ⅰ型膠原的含量 采用雙抗夾心ELIS(A)法，分組同上。按說明書繪制標準曲線，收集上清液測定Ⅰ型膠原的吸光度(A)值，根據(jù)標準曲線計算Ⅰ型膠原的含量。

2.3 RT－PCR 測定ERK1/2 和cyclin D1 mRNA 的表達 RNAiso Plus 提取HSCs 總RNA，核酸蛋白分析儀測定其含量。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以總RNA 1 μg 為模板，用oligo (dT)引物反轉(zhuǎn)錄RNA 為cDNA，然后加入待測定指標的引物進行擴增。ERK1/2(451 bp)上游引物5'－GCT GAC CCT GAG CAC GAC CA－3'，下游引物5'－CTG GTT CAT CTG TCG GAT CA－3';cyclin D1 (449 bp)上游引物5'－TGT TCG TGG CCT CTA AGA TG－3'，下游引物5'－ACT CCA GAA GGG CTT CAA TC－3';β－actin (300 bp)上游引物5'－AGC TGA GAG GGA AAT CGT GCG－3'，下游引物5'－GTG CCA CCA GAC AGC ACT GTG－3'。PCR反應(yīng)條件:ERK1/2(94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃1 min，30 個循環(huán))，cyclin D1(94 ℃30 s，55 ℃30 s，72℃1 min，30 個循環(huán))，內(nèi)參照β－actin(94 ℃45 s，60℃45 s，72 ℃1 min，30 個循環(huán))。PCR 產(chǎn)物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)照相及測定條帶的灰度值，目的條帶與同一樣品的β－actin條帶的灰度值的比值代表mRNA 的表達水平。

2.4 Western blotting 檢測細胞內(nèi)p－ERK 和cyclin D1 蛋白的表達 收集細胞加入裂解液勻漿，低溫離心，蛋白定量。取總蛋白50 μg，經(jīng)10 %聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，封閉后分別加入Ⅰ抗(1∶500)，4 ℃過夜，次日洗膜后再與堿性磷酸酶偶聯(lián)的Ⅱ抗雜交(1∶2 000)，Western Blue? Substrate 顯色。以目的條帶與同一樣品的內(nèi)參照GAPDH 條帶的灰度值的比值代表蛋白的表達量。

2.5 EMSA 法檢測AP－1 與DNA 結(jié)合的活性

(1)細胞核蛋白提取按試劑盒說明書操作。(2)AP－l 寡核苷酸探針的標記:AP－l 的2 段序列為5'－CGC TTG ATG ACT CAG CCG GAA－3' 和3'－GCG AAC TAC TGA GTC GGC CTT－5'。待標記AP－1 寡核苷酸探針(1.75 μmol/L)2 μL，10 ×T4 kanase buffer 1 μL，nuclease－free water 5 μL，［γ－32P］ATP(3.7 ×1014Bq/L)1 μL，T4 polynucleotide kinase 1 μL，總體積10 μL，設(shè)立陰性對照(反應(yīng)體系中未加細胞核提取物)，冷探針競爭反應(yīng)組(在反應(yīng)體系中加入未標記AP－l 雙鏈探針)，37 ℃反應(yīng)10 min。(3)聚丙烯酰胺凝膠電泳和放射自顯影:用考馬斯亮藍G250 試劑盒測定蛋白濃度，取5 μg 核蛋白，按EMSA kit 說明書進行結(jié)合反應(yīng)，室溫下孵育20 min。采用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳，60 V 電泳1 h。將凝膠置濾紙上，壓片，－70 ℃冰箱中放射自顯影24 h，沖洗膠片。將顯影結(jié)果掃描入計算機內(nèi)，以積分灰度值表示AP－l 與DNA 的結(jié)合活性。

3 統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

1 各組大鼠HSC－T6 細胞I 型膠原的表達情況

與對照組比較，PDGF－BB 組Ⅰ型膠原表達量明顯升高(P ＜0.01)。PDGF－BB +Art 各劑量組Ⅰ型膠原表達量均小于PDGF－BB 組(P ＜0.05，P ＜0.01)，經(jīng)PD98059 預處理阻斷ERK1/2 通路后，PDGF－BB 的促HSCs I 型膠原表達的作用也受到抑制，與PDGF－BB 組比較差異顯著(P ＜0.05)，見表1。

表1 各組HSC－T6 細胞培養(yǎng)上清液Ⅰ型膠原濃度的變化Table 1. Changes of collagen Type Ⅰconcentration in cell culture supernatants of HSC－T6 cells in different groups(μg/L. ±s.n=9)

表1 各組HSC－T6 細胞培養(yǎng)上清液Ⅰ型膠原濃度的變化Table 1. Changes of collagen Type Ⅰconcentration in cell culture supernatants of HSC－T6 cells in different groups(μg/L. ±s.n=9)

△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs control group;* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs PDGF－BB group.

Group Dose Collagen type ⅠControl 90.7±10.1 PDGF－BB 60 μg/L 148.8±12.5△△PDGF－BB +Art 6.25 mg/L 122.6±12.1△＊25 mg/L 119.5±14.6△＊50 mg/L 94.1±12.4＊＊PDGF－BB +PD98059 100 μmol/L 115.2±13. 8△＊

2 ERK1/2 和cyclinD1 mRNA 在各組HSC－T6細胞中的表達

RT－PCR 結(jié)果顯示:PDGF－BB 可誘導HSC－T6 細胞內(nèi)ERK1/2 mRNA 的表達增多，但與對照組比較無顯著差異(P ＞0.05)，PDGF－BB + Art(50 mg/L)組，HSCs 細胞內(nèi)ERK1/2 mRNA 的表達量明顯低于PDGF－BB 組(P ＜0.05)，而PDGF－BB +Art(25 mg/L、6.25 mg/L)組與對照組比較無顯著差異(P ＞0.05)，PDGF－BB + PD98059 組ERK1/2mRNA 的表達明顯受到抑制(P ＜0.01);隨著Art劑量增加對cyclin D1 mRNA 表達量的抑制作用逐漸增強，PDGF－BB + Art(25 mg/L、50 mg/L)組與PDGF－BB 組比較有顯著差異(P ＜0.05)，PDGF－BB+PD98059 組cyclinD1 mRNA 的表達量與PDGF－BB 組比較也明顯下降(P ＜0.05)，見圖1。

3 p－ERK1/2 蛋白和cyclin D1 蛋白在各組HSC－T6 細胞中的表達

Western blotting 結(jié)果顯 示:PDGF－BB 可使HSCs 內(nèi)p－ERK1/2 蛋白表達明顯高于對照組(P ＜0.01);加入不同劑量Art 后，HSCs 內(nèi)p－ERK1/2 的表達量下降，隨著Art 劑量增加抑制作用越明顯;PDGF－BB + PD98058 組HSC－T6 細 胞 內(nèi)p－ERK1/2 的表達最低，cyclin D1 蛋白表達趨勢與p－ERK1/2 蛋白相似，見圖2。

4 實驗各組AP－1 活化的情況

抽提細胞核提取物進行EMSA 測定AP－1 活性，檢測到了AP－1 和DNA 形成的復合體陽性信號，Art 干預HSC－T6 細胞后，AP－1 和DNA 形成的復合體陽性信號逐漸減小，且隨Art 濃度的增大，檢測到的信號越小，PDGF－BB + PD98059 組信號更弱，與PDGF－BB 組比較差異顯著(P ＜0.01)，見圖3。

Figure 1. The expression of ERK1/2 and cyclin D1 mRNA in HSC－T6 cells in different groups. A:RT－PCR pictures of ERK1/2 mRNA and cyclin D1 mRNA expression;B:quantitative analysis of the ratios of ERK1/2 and cyclin D1 to β－actin. M:DNA marker;Lane 1:control group;Lane 2:PDGF－BB group;Lane 3:PDGF－BB+Art(6.25 mg/L)treated group;Lane 4:PDGF－BB + Art(25 mg/L)treated group;Lane 5:PDGF－BB + Art(50 mg/L)treated group;Lane 6:PDGF－BB+PD98059(100 μmol/L)treated group. ±s.n=6. △P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs control group;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs PDGF－BB group.圖1 實驗各組HSC－T6 細胞ERK1/2 mRNA and cyclinD1 mRNA 的表達

Figure 2. The protein expression of p－ERK1/2 and cyclin D1 in HSC－T6 cells in different groups. A:Western blotting picture of p－ERK1/2 and cyclin D1 protein expression.Lane 1:control group;Lane 2:PDGF－BB group;Lane 3:PDGF－BB + Art(50 mg/L)treated group;Lane 4:PDGF－BB + Art(25 mg/L)treated group;Lane 5:PDGF－BB +Art(6.25 mg/L)treated group;Lane 6:PDGF－BB +PD98059(100 μmol/L)treated group. B:quantitative analysis of the ratio of p－ERK1/2 and cyclin D1 to GAPDH. ± s. n =6. △P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs control group;* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs PDGF－BB group.圖2 實驗各組HSC－T6 細胞p－ERK1/2 和cyclin D1 蛋白的表達

討 論

肝臟持續(xù)的慢性損傷導致細胞增殖和細胞外基質(zhì)過度沉積逐漸形成肝纖維化。肝纖維化的特征性病理改變是以Ⅰ型膠原為主的細胞外基質(zhì)在肝內(nèi)大量沉積。HSCs 的激活是肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的中心環(huán)節(jié)，被看作是抗纖維化治療的主要靶細胞［4－5］。

Figure 3. EMSA analysis of AP－1 DNA binding activity of each group in HSC－T6 cells. A:autoradiography picture of EMSA;B:densitometry analysis of EMSA. Lane 1:negative control;Lane 2:control group;Lane 3:PDGF－BB group;Lane 4:PDGF－BB+Art(50 mg/L)treated group;Lane 5:PDGF－BB + Art(25 mg/L)treated group;Lane 6:PDGF－BB +Art(6.25 mg/L)treated group;Lane 7:PDGF－BB +PD98059(100 μmol/L)treated group;Lane 8:［γ－ 32P］－labeled AP－1 Oligo plus unlabeled AP－1 Oligo(competitor). ± s. n =6. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs PDGF－BB group.圖3 AP－1 DNA 結(jié)合活性的EMSA 分析

在肝纖維化中，PDGF－BB 是HSCs 最強的有絲分裂原之一，對HSCs 有著極強的促增殖作用。本實驗發(fā)現(xiàn)Art 能有效抑制PDGF 誘導的HSC－T6 分泌Ⅰ型膠原。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen－activated protein kinases，MAPKs)是細胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，研究證實，MAPKs 信號轉(zhuǎn)導通路存在于大多數(shù)細胞內(nèi)，被認為是許多信號通路的共同通道，ERK1/2 是其主要成員。ERK1/2 在肝纖維化過程中的作用已被大量實驗證明，本課題組也證實了ERK1/2 參與了PDGF－BB 所誘導的HSCs 增殖［6］。ERK1/2 位于胞漿內(nèi)，被激活后迅速穿過核膜，ERK活化是將信號從細胞膜表面受體轉(zhuǎn)導至細胞核的關(guān)鍵［7］。本實驗可以看到Art 可抑制PDGF－BB 誘導的HSC－T6 內(nèi)p－ERK1/2 的表達，隨Art 濃度的增加作用增強。而對ERK1/2 mRNA 的抑制作用不明顯，提示Art 對PDGF－BB 刺激的HSCs 增殖和Ⅰ型膠原合成的影響可能主要是抑制ERK1/2 蛋白的活化而實現(xiàn)的。

活化的ERK1/2 通過信號級聯(lián)反應(yīng)作用于核轉(zhuǎn)錄因子如cyclinD1、AP－l 等調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄，引起特定蛋白的表達或活性改變，與細胞的增殖及惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)［8］。本實驗前期研究表明Art 體外可阻止HSC－T6 從G0/G1期進入S 期［3］。近年來對細胞增殖周期的研究表明［9］，細胞周期中存在2 個重要調(diào)控點即G1/S 和G2/M 期調(diào)控點，只要G1期內(nèi)的正性調(diào)節(jié)因子累積達到一定程度，周期越過G1/S交界點，以后細胞就不再依賴于細胞外促生長因子而順序完成整個細胞周期，因而G1/S 調(diào)控點是影響細胞周期的關(guān)鍵。Cyclin D1 特異性地表達于細胞增殖周期的G1期，調(diào)控G0期細胞向G1期的轉(zhuǎn)化，是細胞增殖周期啟動的重要調(diào)控因子。

轉(zhuǎn)錄因子AP－1 在細胞增殖轉(zhuǎn)錄時調(diào)控細胞多種基因的表達［10－11］。AP－1 由Jun 和Fos 家族成員組成，敲除c－jun 基因小鼠胚胎纖維母細胞存在嚴重增殖缺陷，cyclin D1、cyclin E 依賴的激酶活性極低，導致細胞不能通過G1/S 限制點，提示AP－1 的活化能促使細胞周期啟動［12］。有研究認為AP－1是MAPK 信號通路的作用底物之一。ERK /MAPK主要通過轉(zhuǎn)錄因子c－Fos 參與細胞的增殖分化［10］。也有研究表明，在c－Jun/JunB 介導的信號轉(zhuǎn)導通路與細胞周期G1/S 期相關(guān)的重要靶基因cyclin D1 之間有直接聯(lián)系。利用人HeLa 細胞系研究證實，cyclin D1 啟動子上有2 個AP－1 樣結(jié)合位點用以激活cyclin D1 啟動子［13］，且c－Jun 和JunB 的比例決定cyclin D1 在G1期的轉(zhuǎn)錄與細胞周期的平衡，最終調(diào)控cyclin D1 啟動子活性，影響其表達［14－15］，本實驗可看到PD98059 可明顯抑制cyclin D1 基因和蛋白的表達及AP－1 與DNA 的結(jié)合活性?？梢夾P－1的活性和cyclin D1 基因和蛋白達水平受ERK1/2 通路的調(diào)控，但AP－1 和cyclin D1 之間是否也存在相互作用，還需進一步研究。

綜上，本實驗證實Art 能有效抑制ERK1/2 蛋白的活化，同時劑量依賴性地抑制cyclin D1 基因、蛋白表達水平及AP－1 與DNA 的結(jié)合，但抑制作用不如PD98059 明顯，提示Art 對cyclin D1 和AP－1 活性的抑制作用不是直接作用，可能是通過有效抑制ERK1/2 蛋白的活化從而下調(diào)cyclin D1 表達及AP－1 與DNA 的結(jié)合活性。HSCs 的激活和表型變化涉及許多信號通路，并且各條信號通路及信號分子之間存在相互作用。實驗中看到Art 抑制Ⅰ型膠原的作用強于PD98059，提示Art 對HSCs 細胞增殖的其它通路可能還有作用。

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