王朝暉,謝 駿,姜 珊,史婧佳,劉勇斌,龔?fù)麑?(.暨南大學(xué)水生生物研究所,廣東 廣州 506；.暨南大學(xué)生態(tài)學(xué)系,廣東 廣州 506；.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所,廣東 廣州 5080)

商品氯氰菊酯對(duì)斜生柵藻生長(zhǎng)的影響及其生理生化效應(yīng)

王朝暉1,2*,謝 駿3,姜 珊1,史婧佳2,劉勇斌2,龔?fù)麑?(1.暨南大學(xué)水生生物研究所,廣東 廣州 510632；2.暨南大學(xué)生態(tài)學(xué)系,廣東 廣州 510632；3.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所,廣東 廣州 510380)

研究了商品氯氰菊酯對(duì)斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)生長(zhǎng)及生理生化指標(biāo)的影響,以了解除蟲(chóng)菊酯農(nóng)藥對(duì)水生態(tài)系統(tǒng)的影響.在氯氰菊酯暴露下,藻細(xì)胞生長(zhǎng)受到明顯抑制,氯氰菊酯對(duì)斜生柵藻生長(zhǎng)的72h半效應(yīng)濃度(EC50)為2.37mg/L.藻細(xì)胞所有生理生化指標(biāo)對(duì)氯氰菊酯響應(yīng)迅速,12h到達(dá)最大促進(jìn)或者抑制效果,48h后趨于平穩(wěn).其中12h處理,可溶性糖和可溶性蛋白含量上升,中等濃度組的促進(jìn)作用最強(qiáng);超氧化物歧化酶(SOD)活性則呈現(xiàn)出低濃度促進(jìn)、高濃度抑制效應(yīng).氯氰菊酯能促進(jìn)藻細(xì)胞膜脂氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)的產(chǎn)生,且呈現(xiàn)出明顯的劑量—效應(yīng)關(guān)系,MDA含量可以作為監(jiān)測(cè)氯氰菊酯污染的生物標(biāo)記指標(biāo)之一.研究結(jié)果表明,SOD活性抑制以及膜脂氧化是氯氰菊酯對(duì)斜生柵藻的重要致毒機(jī)理,但自然環(huán)境中的氯氰菊酯水平不會(huì)對(duì)淡水水體浮游藻類(lèi)的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用.

氯氰菊酯；毒性；斜生柵藻；生長(zhǎng)；超氧化物歧化酶；丙二醛

擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥是一類(lèi)含有苯氧烷基的環(huán)丙烷酯,最初是從除蟲(chóng)菊類(lèi)(Pyrethrum, Cinerariae folium)植物中所含的有效成分除蟲(chóng)菊素發(fā)展而成的.擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥具有很強(qiáng)生物活性以及良好的環(huán)境兼容性,在防治衛(wèi)生害蟲(chóng)和農(nóng)作物害蟲(chóng)中有重要地位[1].近年來(lái),隨著一批高毒農(nóng)藥的禁用,菊酯類(lèi)農(nóng)藥的使用量越來(lái)越大,對(duì)其毒性的研究也越來(lái)越引起人們的重視.

擬除蟲(chóng)菊酯農(nóng)藥已廣泛用于農(nóng)田、森林和家用殺蟲(chóng),隨著它們使用范圍的擴(kuò)大、使用頻率的增加,它們進(jìn)入水體的機(jī)會(huì)也就越來(lái)越大,對(duì)水生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生一定影響.同時(shí),擬除蟲(chóng)菊酯農(nóng)藥也廣泛使用于水產(chǎn)養(yǎng)殖,主要用于養(yǎng)殖動(dòng)物的寄生蟲(chóng)疾病防治[2].擬除蟲(chóng)菊酯雖然對(duì)哺乳動(dòng)物等非靶生物低毒,但它們對(duì)魚(yú)類(lèi)和其它水生動(dòng)物毒性很高[3-4],大部分LC50值在5μg/L以下[5-6].而且擬除蟲(chóng)菊酯農(nóng)藥屬于疑似環(huán)境激素類(lèi)[7-8],對(duì)浮游動(dòng)物的生長(zhǎng)和繁殖具有一定的慢性毒素和致突變能力[9-10],并且能夠影響水生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能,從而對(duì)水生態(tài)環(huán)境造成長(zhǎng)遠(yuǎn)影響[10-12].

擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥對(duì)水生態(tài)系統(tǒng)影響已有較多報(bào)道,但大多集中在水生動(dòng)物毒性的研究方面[5-7],而擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥對(duì)藻類(lèi)的毒性研究則比較少[11,13-17].藻類(lèi)作為水生態(tài)系統(tǒng)的初級(jí)生產(chǎn)者,其種類(lèi)多樣性和初級(jí)生產(chǎn)量直接影響水生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能.此外,目前大部分有關(guān)農(nóng)藥的毒理學(xué)研究報(bào)道中使用的為純品農(nóng)藥,對(duì)商品農(nóng)藥中乳化劑和溶劑的毒性未予考量,而溶劑與乳化劑對(duì)水生生物也具有一定毒害作用[18].因此,在毒理學(xué)研究中,使用市售商品農(nóng)藥作為實(shí)驗(yàn)藥品能更為科學(xué)和全面地評(píng)價(jià)農(nóng)藥對(duì)環(huán)境的影響.

因此,本文選擇目前使用最為普遍、用量最大的擬除蟲(chóng)菊酯—氯氰菊酯作為實(shí)驗(yàn)材料,研究了商品氯氰菊酯對(duì)典型淡水藻類(lèi)斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)的生長(zhǎng)、細(xì)胞內(nèi)含物及抗氧化酶和膜脂氧化指標(biāo)的影響,以考察商品氯氰菊酯對(duì)藻類(lèi)的毒性和致毒機(jī)理,為擬除蟲(chóng)菊酯農(nóng)藥在水環(huán)境的安全使用提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藻類(lèi)的來(lái)源與培養(yǎng)

本實(shí)驗(yàn)藻種為斜生柵藻,來(lái)自于暨南大學(xué)水生生物研究所藻種室.實(shí)驗(yàn)藻種在 BG11培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),培養(yǎng)條件為溫度 20℃,光照強(qiáng)度為100μmol/(m2?s),光暗比為12h:12h.藻細(xì)胞在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期反復(fù)接種3次后進(jìn)行實(shí)驗(yàn),待達(dá)到同步培養(yǎng)后進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

1.2 試驗(yàn)藥品

氯氰菊酯為江門(mén)市大光明農(nóng)化有限公司生產(chǎn)的含 10%氯氰菊酯的市售乳油.用丙酮配制成2000,3600,6400,11200,20000mg/L氯氰菊酯母液,在4℃下避光保存.

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)預(yù)備實(shí)驗(yàn)結(jié)果,0.5‰(體積比)的丙酮對(duì)柵藻的生長(zhǎng)及生理生化指標(biāo)不產(chǎn)生明顯影響,因此試驗(yàn)液中溶劑丙酮含量設(shè)為 0.5‰,對(duì)照組中添加同樣濃度的丙酮.

實(shí)驗(yàn)設(shè)置1個(gè)對(duì)照組和5個(gè)實(shí)驗(yàn)組,各組中氯氰菊酯濃度分別為0,1,1.8,3.2,5.6,10mg/L.實(shí)驗(yàn)容器為1000mL三角瓶,培養(yǎng)體積600mL.每個(gè)濃度設(shè)置 3個(gè)平行,實(shí)驗(yàn)所有容器和培養(yǎng)基均經(jīng)過(guò)121℃、20min高壓蒸汽滅菌.培養(yǎng)條件與 1.1相同.每天手動(dòng)搖瓶3次,實(shí)驗(yàn)持續(xù) 72h,實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的 0,3,6,12,24,48,72h,取樣進(jìn)行各種指標(biāo)的測(cè)定.

1.4 分析測(cè)定

1.4.1 細(xì)胞數(shù)量 在藻細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期測(cè)定葉綠素?zé)晒?美國(guó)Turner Designs公司Trilogy實(shí)驗(yàn)室熒光儀),并計(jì)數(shù)藻細(xì)胞密度,得到葉綠素?zé)晒馀c藻細(xì)胞密度的相關(guān)關(guān)系:y = 0.0039x + 2627, R2= 0.98,其中y為葉綠素?zé)晒庵?x為藻細(xì)胞密度.在上述規(guī)定時(shí)間取樣,測(cè)定葉綠素?zé)晒庵?并換算成藻細(xì)胞密度.

1.4.2 可溶性蛋白和氧化物歧化酶(SOD)活性的測(cè)定 酶粗提取液根據(jù)Wang等[7]的方法進(jìn)行,取 50mL藻液,在 4℃、10000r/min條件下離心10min,去上清液,留藻泥,-20℃冷凍保存.加 5mL pH7.8磷酸緩沖液,間斷性超聲波冰浴破碎30min,鏡檢無(wú)完整細(xì)胞后,反復(fù)凍融2～3次.然后在4℃、10000r/min下離心 10min,上清液即為酶粗提液,用于可溶性蛋白和SOD活性的測(cè)定.

可溶性蛋白含量測(cè)定采用考馬斯亮蘭法[19].用小牛血清蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=0.1011x-0.0917, R2=0.999),取1mL酶液(對(duì)照組為1mL磷酸緩沖液),加5mL考馬斯亮蘭溶液,混勻,測(cè)定595nm處吸光值.

SOD活性采用氮蘭四唑(NBT)法測(cè)定[20],反應(yīng)管內(nèi)依次加入 pH7.8磷酸緩沖液 3mL、130 mmol/L的甲硫氨酸溶液 0.6mL、0.057mmol/L的NBT溶液0.6mL、750μmol/L的EDTA-Na2溶液0.6mL、20μmol/L的核黃素溶液0.6mL、酶液0.5mL (對(duì)照組加入等量磷酸緩沖液)、蒸餾水1mL,混勻后,對(duì)照管避光,試驗(yàn)組在 50～60μmol/(m2?s)、20℃下反應(yīng)30min,遮光中止反應(yīng).以遮光的對(duì)照管為空白,在560nm波長(zhǎng)下測(cè)定各管的吸光度,計(jì)算SOD活性.以能抑制NBT光化學(xué)還原50%的酶量為1個(gè)SOD單位,用U表示.SOD酶活性以單位細(xì)胞酶活性(U/108cells)以及單位蛋白酶活性(U/μg protein)表示.

1.4.3 可溶性糖與丙二醛(MDA)含量的測(cè)定 取 50mL藻液,于 4℃、10000r/min離心10min,去上清,藻泥置于-20℃保存.取出冷凍的藻泥,加入 5mL 三氯乙酸溶液,搖勻,超聲波冰浴破碎,置于 4℃、10000r/min離心 10min,上清為待測(cè)液.

測(cè)定可溶性糖和 MDA采用硫代巴比妥酸(TBA)法[21],取1mL上清液,加入2mL TBA,沸水中加熱15min,迅速放入冰水中冷卻,測(cè)定450,532, 600nm處的吸光值,計(jì)算可溶性糖和MDA含量.

1.5 計(jì)算與統(tǒng)計(jì)分析

1.5.1 半效應(yīng)濃度(EC50)的計(jì)算 藻細(xì)胞生長(zhǎng)的特定生長(zhǎng)率(μ, d-1)由以下公式進(jìn)行計(jì)算:

式中:N0為初始細(xì)胞密度; Nt是培養(yǎng)t d時(shí)的細(xì)胞密度.

生長(zhǎng)抑制百分率(EC)定義為氯氰菊酯抑制生長(zhǎng)率的百分比:

式中: μc是對(duì)照組的特定生長(zhǎng)率; μi是試驗(yàn)組i的特定生長(zhǎng)率.

EC50值采用抑制百分率的概率單位濃度對(duì)數(shù)直線回歸法進(jìn)行計(jì)算,并計(jì)算EC50的95%可信限范圍.

1.5.2 統(tǒng)計(jì)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行處理,結(jié)果均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,用SPSS13.0軟件進(jìn)行顯著性差異分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 急性暴露氯氰菊酯對(duì)斜生柵藻生長(zhǎng)的影響

在不同濃度的氯氰菊酯暴露下,斜生柵藻的生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖 1.在添加了氯氰菊酯的各實(shí)驗(yàn)組中,藻細(xì)胞的生長(zhǎng)受到明顯抑制,且抑制程度與氯氰菊酯的濃度正相關(guān).暴露 3h,高濃度組(＞3.2mg/L)藻細(xì)胞數(shù)量明顯下降(P＜0.05),12h內(nèi)均維持較低密度;隨后細(xì)胞密度緩慢上升,但直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束的 72h,最高濃度組(10mg/L)細(xì)胞密度仍低于接種密度.在暴露的前 48h,兩個(gè)低濃度組(＜1.8mg/L)的生長(zhǎng)與對(duì)照組無(wú)明顯差異,但在隨后的 24h內(nèi)對(duì)照組的生長(zhǎng)明顯優(yōu)于暴露組,至72h所有實(shí)驗(yàn)組藻細(xì)胞密度均與對(duì)照組有明顯差異(P＜0.05).氯氰菊酯對(duì)斜生柵藻生長(zhǎng)的 72h半抑制濃度(EC50)為 2.37mg/L,95%的可信限范圍為1.37～4.09mg/L.

圖1 氯氰菊酯暴露下斜生柵藻的生長(zhǎng)Fig.1 The growth of Scenedesmus obliquus under the exposure of cypermethrin

2.2 氯氰菊酯對(duì)斜生柵藻細(xì)胞內(nèi)含物的影響

2.2.1 可溶性蛋白 藻細(xì)胞可溶性蛋白含量在暴露初期的24h內(nèi)變化較為顯著,暴露組均表現(xiàn)出不同程度的促進(jìn)作用,而對(duì)照組則保持平穩(wěn).低濃度組(＜3.2mg/L)可溶性蛋白含量在 12h內(nèi)呈上升趨勢(shì),促進(jìn)作用隨著濃度的增加而增加,最大值為 3.2mg/L濃度組的 12h暴露,達(dá)9.66μg/108cells,為同期對(duì)照組的1.38倍;之后逐漸下降趨于平穩(wěn).高濃度組(＞5.6mg/L)則在 12h內(nèi)出現(xiàn)一些波動(dòng),整體來(lái)說(shuō)是促進(jìn)作用,但在 6h時(shí),含量突然下降,12h時(shí)又上升,48h后逐漸達(dá)到平穩(wěn)(圖2).

圖2 氯氰菊酯暴露下斜生柵藻可溶性蛋白的變化Fig.2 Contents of soluble protein in Scenedesmus obliquus under the exposure of cypermethrin

2.2.2 可溶性糖 可溶性糖含量的變化規(guī)律與可溶性蛋白相近(圖3),同樣也在實(shí)驗(yàn)初期的24h內(nèi)變化較為顯著,高濃度組與低濃度組均表現(xiàn)出不同程度的促進(jìn)作用,48h后含量趨于穩(wěn)定.其中3.2mg/L對(duì)可溶性糖的促進(jìn)作用最強(qiáng),最高值(61.6mg/108cells)出現(xiàn)在3.2mg/L濃度組12h暴露,是同期對(duì)照組的2.27倍.而其他4個(gè)濃度組的促進(jìn)作用相近,比較而言,最低濃度的1mg/L促進(jìn)作用最小,而對(duì)照組則保持平穩(wěn).

圖3 氯氰菊酯暴露下斜生柵藻可溶性糖的變化Fig.3 Contents of soluble sugar in Scenedesmus obliques under the exposure of cypermethrin

2.3 氯氰菊酯對(duì)斜生柵藻抗氧化酶的影響

斜生柵藻體內(nèi)SOD對(duì)氯氰菊酯的響應(yīng)明顯(圖 4a).暴露 12h時(shí),低濃度組(＜1.8mg/L)藻細(xì)胞SOD 活性均被最大程度促進(jìn)(P＜0.01),其中1.8mg/L濃度組達(dá)到最大值,為1.19 U/108cells,是對(duì)照組的 1.51倍;而高濃度(＞3.2mg/L)則被抑制至最低值,其中10mg/L在12h達(dá)到最小值3.44 U/108cells,僅為對(duì)照組的43.7%.隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng),48 h后各實(shí)驗(yàn)組的SOD活性趨于一致.值得注意的是,對(duì)照組SOD活性也在12h有所增加,可能是由于新的生長(zhǎng)環(huán)境致使藻細(xì)胞出現(xiàn)抗逆反應(yīng),此外對(duì)照組培養(yǎng)基中加入的少量丙酮可能也會(huì)產(chǎn)生一定抗逆反應(yīng).

圖4 氯氰菊酯暴露下斜生柵藻SOD活性的變化Fig.4 Superoxide dismutase (SOD) activity in Scenedesmus obliques under the exposure of cypermethrin

單位蛋白SOD酶活性能夠剔除藻細(xì)胞大小對(duì)酶活性的影響,有利于不同種類(lèi)的微藻之間SOD酶活性的比較.本研究中,單位蛋白SOD酶活性變化與單位細(xì)胞酶活性相近(圖 4b),只是在3.2mg/L試驗(yàn)組的抑制作用更為明顯,分析其原因,與該濃度組較高的蛋白含量有關(guān)(圖2).

2.4 氯氰菊酯對(duì)斜生柵藻膜脂氧化產(chǎn)物的影響

MDA是指示藻細(xì)胞內(nèi)膜脂氧化程度的重要指標(biāo).所有試驗(yàn)組暴露初期 MDA含量就出現(xiàn)明顯上升,并且隨著濃度增加而增加,呈現(xiàn)出明顯的濃度—效應(yīng)關(guān)系(圖 5).暴露 12h后,10mg/L組MDA含量達(dá)到最高值,為44.7μmol/108cells,是對(duì)照組的 2.86倍;其他濃度組也分別在暴露后6～12h時(shí)達(dá)到最高值,24h后MDA值逐漸回落至正常水平.雖然所有供試濃度的氯氰菊酯對(duì)藻細(xì)胞 MDA含量具有明顯的促進(jìn)作用,但對(duì)照組MDA水平一直維持平穩(wěn).

圖5 氯氰菊酯暴露下斜生柵藻丙二醛(MDA)含量的變化Fig. 5 Variation in malondialdehyde (MDA) contents in Scenedesmus obliquus under the exposure of cypermethrin

3 討論

3.1 斜生柵藻對(duì)氯氰菊酯的敏感性

氯氰菊酯對(duì)水生生物毒性大小因受試生物的不同而有一定差異.對(duì)水生浮游動(dòng)物24h LC50一般在 5μg/L以下,對(duì)魚(yú)類(lèi) 96h LC50約為 0.1～10μg/L,而對(duì)蝦類(lèi)96h LC50甚至小于0.1μg/L[5-6].藻類(lèi)對(duì)氯氰菊酯的敏感性較低,72～96h EC50一般在1mg/L以上[22],氯氰菊酯純品農(nóng)藥對(duì)斜生柵藻96h EC50為112mg/L[13];10～50mg/L的氯氰菊酯抑制雙對(duì)柵藻的生長(zhǎng),卻刺激或稍抑制聚球藻的生長(zhǎng)[23].海洋藻類(lèi)對(duì)氯氰菊酯的敏感性較高, 96h EC50為100μg/L左右[16].

從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看,斜生柵藻對(duì)氯氰菊酯的敏感性雖低于水生動(dòng)物以及海洋微藻,但EC50值(2.37mg/L)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于 Xiong等[13]的研究結(jié)果(112mg/L),這可能與本研究中所使用的商品農(nóng)藥有關(guān).市售商品農(nóng)藥包括溶劑、乳化劑等輔劑,這些附加物對(duì)環(huán)境的危害有時(shí)甚至高于農(nóng)藥本身.擬除蟲(chóng)菊酯市售農(nóng)藥一般以二甲苯作為溶劑、8%的農(nóng)乳 2201作為乳化劑配制而成的乳油,而溶劑和乳化劑本身也具有一定的毒性[18].此外,氯氰菊酯難溶于水,在水中溶解度為5～10μg/L[24].使用純品農(nóng)藥作為實(shí)驗(yàn)藥品,當(dāng)試驗(yàn)液中氯氰菊酯濃度大于其在水中溶解度時(shí),如果不添加適當(dāng)?shù)娜榛瘎?水體中氯氰菊酯的實(shí)際濃度遠(yuǎn)低于配制濃度.而劉濤等也發(fā)現(xiàn),高效氯氰菊酯商品乳油對(duì)斜生柵藻毒性較高,72h和 96h EC50分別為4.03,2.87mg/L[14].由此說(shuō)明,試液中的有效濃度是決定氯氰菊酯生物毒性的重要因素.本課題組研究發(fā)現(xiàn),氯氰菊酯商品農(nóng)藥與純品農(nóng)藥(以丙酮為溶劑、8%的吐溫 60為乳化劑)對(duì)海洋微藻的毒性沒(méi)有明顯差別[16-17],而且在預(yù)備實(shí)驗(yàn)中我們也發(fā)現(xiàn)使用吐溫60為乳化劑、丙酮為溶劑,氯氰菊酯原藥(有效成分含量＞96%)對(duì)斜生柵藻的毒性與商品農(nóng)藥相近.因此,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的差異,主要是由于試驗(yàn)液中氯氰菊酯有效濃度的差異所致.鑒于商品農(nóng)藥中附加劑也具有一定環(huán)境危害,作者認(rèn)為使用商品農(nóng)藥來(lái)研究其毒性效應(yīng)能更為準(zhǔn)確地評(píng)估其對(duì)生態(tài)環(huán)境的影響.

擬除蟲(chóng)菊酯屬于高親脂性化合物,在自然水體中極易與懸浮顆粒吸附,而且較易降解,因此,在自然水體中菊酯類(lèi)農(nóng)藥的殘留量較低[25].在井水和自來(lái)水中無(wú)氯氰菊酯殘留,而河水中可以檢測(cè)出氯氰菊酯[26],城市污水中也能監(jiān)測(cè)出氯氰菊酯,但殘留量一般小于 1μg/L[27].本實(shí)驗(yàn)設(shè)置的氯氰菊酯濃度為 mg/L級(jí)別,遠(yuǎn)高于自然水體中氯氰菊酯的殘留濃度.因此,可以得出環(huán)境中的氯氰菊酯濃度不會(huì)對(duì)淡水水體浮游藻類(lèi)的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用,但極低濃度的氯氰菊酯對(duì)藻類(lèi)的生長(zhǎng)是否具有促進(jìn)作用還有待進(jìn)一步研究.

3.2 氯氰菊酯對(duì)斜生柵藻致毒機(jī)理的探討

在氯氰菊酯暴露下,斜生柵藻可溶性蛋白和可溶性糖含量以及SOD活性和MDA含量均在短時(shí)間內(nèi)做出反應(yīng),但在暴露后期基本恢復(fù)至正常水平.氯氰菊酯作為一種高親脂性化合物(log Kow≈6.6),與細(xì)胞接觸后,能迅速通過(guò)膜脂質(zhì)雙分子層進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部[25],從而使細(xì)胞迅速做出響應(yīng);但隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng),藻類(lèi)細(xì)胞逐漸適應(yīng)毒害環(huán)境,而且農(nóng)藥濃度由于降解、吸附而下降[16],藻細(xì)胞各類(lèi)指標(biāo)也逐漸恢復(fù)至正常水平.

可溶性蛋白是存在于細(xì)胞中的非膜結(jié)合蛋白體系,在植物體內(nèi)有貯存營(yíng)養(yǎng)、抵抗極端環(huán)境等作用,同時(shí)植物體內(nèi)的可溶性蛋白質(zhì)大多數(shù)是參與各種代謝的酶類(lèi),測(cè)其含量是了解植物體總體代謝水平的一個(gè)重要指標(biāo).本實(shí)驗(yàn)中斜生柵藻可溶性蛋白含量在暴露初期得到極大促進(jìn),并且在中等濃度下促進(jìn)作用最為顯著.說(shuō)明藻細(xì)胞受到中度脅迫時(shí),能迅速合成大量可溶性蛋白,從而提供更多的代謝酶類(lèi)抵抗不良環(huán)境.隨著毒物降解、濃度降低,且對(duì)周?chē)涣辑h(huán)境的逐漸適應(yīng),可溶性蛋白的含量逐漸恢復(fù)至正常水平.

可溶性糖包括還原糖(葡萄糖、果糖、麥芽糖等)和非還原糖(蔗糖等),與植物的生長(zhǎng)發(fā)育、呼吸代謝等各個(gè)方面都息息相關(guān).在氯氰菊酯脅迫下,可溶性糖含量同樣明顯增加.說(shuō)明在毒性脅迫環(huán)境下,植物為了適應(yīng)逆境的條件,會(huì)主動(dòng)積累可溶性糖和可溶性蛋白等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì).

在逆境脅迫下,植物體內(nèi)都能夠產(chǎn)生大量的活性氧物質(zhì)(如O2-、-OH及H2O2等)[28],活性氧物質(zhì)能夠破壞蛋白質(zhì)、葉綠體、細(xì)胞膜的流動(dòng)性及核酸等,擾亂有機(jī)體的動(dòng)態(tài)平衡[29].為了消除或減少活性氧物質(zhì)對(duì)植物造成的損傷,植物在抗氧化物質(zhì)的基礎(chǔ)上形成了多種防護(hù)機(jī)制[30-31].O2-是最重要的活性氧物質(zhì),其大量存在主要來(lái)源于過(guò)剩電子傳遞給O2進(jìn)而形成了O2-,O2-具有非常大的破壞作用,能夠引起細(xì)胞的死亡和器官的衰老.SOD被認(rèn)為是防衛(wèi)O2-傷害的第一步,它可以將O2-轉(zhuǎn)化為氧化能力較弱的 H2O2,并在其他酶的作用下最終轉(zhuǎn)化為H2O和O2[28].

低濃度的氯氰菊酯雖然對(duì)藻細(xì)胞生長(zhǎng)、內(nèi)含物含量基本沒(méi)有影響,但是對(duì) SOD活性有明顯的促進(jìn)作用.在暴露初期,低濃度(＜3.2mg/L)對(duì) SOD活性具有促進(jìn)作用,而當(dāng)農(nóng)藥濃度超過(guò)3.2mg/L則被抑制.結(jié)果說(shuō)明藻細(xì)胞能及時(shí)調(diào)動(dòng)抗氧化機(jī)制,促進(jìn)抗氧化機(jī)能,從而降低低強(qiáng)度逆境對(duì)藻細(xì)胞生長(zhǎng)和生理機(jī)能的影響.但隨著氯氰菊酯濃度的增加,超過(guò)了細(xì)胞的耐受極限,脂質(zhì)過(guò)氧化帶來(lái)的損傷大于細(xì)胞自身的修復(fù)能力,SOD活性受到明顯抑制,自由基產(chǎn)生和消除之間的平衡被破壞,細(xì)胞開(kāi)始受到毒害,斜生柵藻的生長(zhǎng)也受到明顯抑制.

氯氰菊酯暴露組 MDA含量均在短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)明顯上升趨勢(shì),而且在SOD活性高的濃度組MDA的促進(jìn)作用較小,說(shuō)明SOD活性的提高能緩解膜脂氧化程度,從而對(duì)細(xì)胞膜具有一定的保護(hù)作用;但當(dāng)脅迫強(qiáng)度增加,在本實(shí)驗(yàn)中具體表現(xiàn)為氯氰菊酯濃度增加,SOD受到破壞,活性下降,最終導(dǎo)致膜脂氧化程度急劇上升,藻細(xì)胞生長(zhǎng)也受到明顯抑制.由此可見(jiàn),SOD活性抑制以及膜脂氧化是氯氰菊酯對(duì)斜生柵藻的重要致毒機(jī)理.此外,MDA含量變化敏感,呈現(xiàn)出明顯的劑量—效應(yīng)關(guān)系,可以作為監(jiān)測(cè)氯氰菊酯污染的生物標(biāo)記指標(biāo)之一.

4 結(jié)論

4.1 氯氰菊酯對(duì)斜生柵藻具有一定毒性,對(duì)藻細(xì)胞生長(zhǎng) 72h半效應(yīng)濃度(EC50)為 2.37mg/L,但自然水體中氯氰菊酯殘留不會(huì)對(duì)柵藻的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用.

4.2 藻細(xì)胞各種生理生化指標(biāo)如可溶性蛋白、可溶性糖、超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)對(duì)氯氰菊酯響應(yīng)迅速,在暴露后24h內(nèi)達(dá)到最大促進(jìn)或者抑制作用,48h后恢復(fù)至正常水平.

4.3 SOD活性的抑制以及膜脂過(guò)氧化可能是氯氰菊酯對(duì)斜生柵藻產(chǎn)生毒害作用的重要原因.

4.4 MDA含量變化敏感,呈現(xiàn)出明顯的劑量—效應(yīng)關(guān)系,可以作為監(jiān)測(cè)氯氰菊酯污染的生物標(biāo)記指標(biāo)之一.

[1] Amweg E L, Weston D P, Ureda N M. Use and toxicity of pyrethroid pesticides in the Central Valley, California, USA [J]. Environmental Toxicology and Chemistry, 2005,24:966-972.

[2] Das B K, Mukherjee S C. Toxicity of cypermethrin in Labeo rohita fingerlings: biochemical, enzymatic and haematological consequences [J]. Comparative Biochemistry and Physiology C-Toxicology and Pharmacology, C 2003,134:109-121.

[3] 王朝暉,尹伊偉,林小濤,等.擬除蟲(chóng)菊酯農(nóng)藥對(duì)水生態(tài)系統(tǒng)的生態(tài)毒理學(xué)研究綜述 [J]. 暨南大學(xué)大學(xué)學(xué)報(bào), 2000,21(3):123-127.

[4] Adam O, Badot P, Degiorgi F, et al. Mixture toxicity assessment of wood preservative pesticides in the freshwater amphipod Gammarus pulex (L.) [J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2009,72:441-449.

[5] Clark J, Goodman L, Borthwick P, et al. Toxicity of pyrethroids to marine invertebrates and fish: a literature review and test results with sediment-sorbed chemicals [J]. Environmental Toxicology and Chemistry, 1989,8:393-401.

[6] Coats J R, Symonik DM, Bradbury S P, et al. Toxicology of synthetic pyrethroids in aquatic organisms: an overview [J]. Environmental Toxicology and Chemistry, 1989,8:671-679.

[7] 邴 欣,汝少?lài)?guó).四種擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥的環(huán)境雌激素活性研究[J]. 中國(guó)環(huán)境科學(xué), 2009,29(2):152-156.

[8] 李文艷,楊宏莉,蔣 雪,等.氯氰菊酯和高效氯氰菊酯的生殖毒性研究進(jìn)展 [J]. 環(huán)境與健康雜志, 2010,27(7):652-654.

[9] 譚亞軍,李少南,吳小毛.幾種殺蟲(chóng)劑對(duì)大型蚤的慢性毒性 [J].農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào), 2004,6(3):62-66.

[10] Medina M, Barata C, Telfer T, et al. Effects of cypermethrin on marine plankton communities: a simulated field study using mesocosms [J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2004, 58:236-245.

[11] Ma J. Differential sensitivity of three cyanobacterial and five green algal species to organotins and pyrethroids pesticides [J]. Science of the Total Environment, 2005,341:109-117.

[12] Sánchez-Fortún S, Barahona M V. Comparative study on the environmental risk induced by several pyrethroids in estuarine and freshwater invertebrate organisms [J]. Chemosphere, 2005,59: 553-559.

[13] Xiong L, Xie P, Sheng X, et al. Toxicity of cypermethrin on growth, pigments, and superoxide dismutase of Scenedesmus obliques [J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2005,60: 188-192.

[14] 劉 濤,熊 麗,生秀梅,等.高效氯氰菊酯對(duì)斜生柵藻的毒性研究 [J]. 化學(xué)與生物工程, 2006,23(7):37-39.

[15] 姜彬慧,張雪嬌,姜 莉,等.溴氰菊酯對(duì)蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)的毒性效應(yīng) [J]. 遼寧大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2009,36(1):73-76.

[16] Wang Z, Yang Y, Yue W, et al. The growth behavior of three marine phytoplankton species in the presence of commercial cypermethrin [J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2010,73:1408-1414.

[17] Wang Z, Nie X, Yue W, et al. Physiological responses of three marine microalgae exposed to cypermethrin [J]. Environmental Toxicology, 2011, DOI: 10.1002/tox.20678

[18] 林秋奇,駱育敏,尹伊偉.兩種乳化劑對(duì)大鱗副泥鰍(Paramisgurnus dabryanus) 胚胎、魚(yú)苗的亞慢性毒性 [J]. 暨南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)與醫(yī)學(xué)版), 1998,19(5):116-119.

[19] Bradford M M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding [J]. Analytical Biochemistry, 1976,72:248-254.

[20] Beauchamp C, Fridovich I. Superoxide dismutase: improved assays and an assay applicable to polyacrylamide gels [J]. Analytical Biochemistry, 1971,44:276-286.

[21] 陳建勛,王曉峰.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo) [M]. 廣州:華南理工大學(xué)出版社, 2006.

[22] Hill I R. Aquatic organisms and pyrethroids [J]. Pesticide Science, 1989,27:429-465.

[23] Megharaj M, Venkateswarlu K, Rao A S. Influence of cypermethrin and fenvalerate on a green alga and three cyanobacteria isolated from soil [J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 1987,14:142-146

[24] World Health Organisation (WHO). Alpha-cypermethrin. Environmental Health Criteria. World Health Organisation, Geneva. 1992.

[25] Hill I R, Shaw J F, Maund S J. Review of aquatic field tests with pyrethroid insecticides [A]. In: Hill I R, Heimbach F, Leeuwangh P, et al. (eds) Freshwater Field Tests for Hazard Assessment of Chemicals. Boca [C] Raton FL: Lewis Publisher, 1994,249-271.

[26] 臧曉歡,王 春,高書(shū)濤,等.分散液相微萃取一氣相色譜聯(lián)用分析水樣中菊酯類(lèi)農(nóng)藥殘留 [J]. 分析化學(xué), 2008,36(6):765- 769.

[27] 陳 明,任 仁,王子健,等.城市污水處理廠水樣中菊酯類(lèi)農(nóng)藥殘留分析 [J]. 中國(guó)環(huán)境監(jiān)測(cè), 2007,23(1):27-30.

[28] Farber J L. Mechanisms of cell injury by activated oxygen species [J]. Environmental Health Perspectives, 1994,102(Suppl 10):17-24.

[29] Smirnoff N. The role of active oxygen in the response of plants to water deficit and desiccation [J]. New Phytologist, 1993,125:27-58.

[30] Kumar S, Habib K, Fatma T. Endosulfan induced biochemical changes in nitrogen-fixing cyanobacteria [J]. Science of the Total Environment, 2008,403:130-138.

[31] Sabatini S E, Juárez á B, Eppis M, et al. Oxidative stress and antioxidant defenses in two green microalgae exposed to copper [J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2009,72:1200-1206.

Effects of commercial cypermethrin on the growth of Scenedesmus obliquus and its physiochemical responses.

WANG Zhao-hui1,2*, XIE Jun3, JIANG Shan1, SHI Jing-jia2, LIU Yong-bin2, GONG Wang-bao3(1.Institute of Hydrobiology, Jinan University, Guangzhou 510632, China；2.Department of Ecology, Jinan University, Guangzhou 510632, China；3.Pearl River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510380, China). China Environmental Science, 2012,32(4)：659～665

The effects of commercial cypermethrin on growth and physiochemical parameters of Scenedesmus obliquus were investigated by 72 h growth tests in a batch-culture system. The purpose was to understand influences of commercial pyrethroid insecticides on aquatic ecosystem. The growth of algal cells was inhibited by cypermethrin in a dose-dependent pattern. The 72 h median effect concentration (EC50) was 2.37 mg/L. All biochemical parameters varied significantly within 12 h exposure, and were stable after 24 h exposure. Cellular contents of soluble protein and sugar were enhanced under the stress of cypermethrin, and the maximum magnification occurred at the moderate concentrations. Activity of superoxide dismutase (SOD) was stimulated at low concentrations and inhibited at high concentrations. However, content of f lipid peroxidation (malondialdehyde, MDA) increased significantly with the increasing of concentration, indicating the potential of using MDA as the biomarker for cypermethrin pollution. The results from this study suggest that the inactivation of SOD activity and consequent lipid peroxidation may be crucial toxic mechanism for cypermethrin to algal cell; however background levels of cypermethrin in natural waters will not inhibit the growth of phytoplankton.

cypermethrin；toxicity；Scenedesmus obliquus；growth；superoxide dismutase (SOD)；malondialdehyde (MDA)

2011-07-28

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)(nycytx-49);中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金

* 責(zé)任作者, 教授, twzh@jnu.edu.cn

X171.5

A

1000-6923(2012)04-0659-07

王朝暉(1968-),女,湖南長(zhǎng)沙人,教授,博士,主要研究方向?yàn)樗h(huán)境科學(xué)和生態(tài)毒理學(xué).發(fā)表論文100余篇.