曲曉星 孫路明 陶炯

（1.同濟(jì)大學(xué)附屬第一婦嬰保健院 上海市產(chǎn)前診斷中心，上海 200040；

2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬國際和平婦幼保健院 產(chǎn)前診斷中心，上海 200030）

1 脊髓肌肉萎縮癥（spinal muscular atrophy，SMA）臨床特征

SMA是常見的兒童致死性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，發(fā)病率為1／6000～1／10 000。該病以脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元退化為病理特征，臨床主要表現(xiàn)為進(jìn)行性、對稱性近端肌無力和肌萎縮。根據(jù)發(fā)病年齡和疾病進(jìn)展，常將SMA分為3種亞型［1］，其中Ⅰ型（又稱韋尼-霍夫曼病，Werdnig-Hoffmann disease，MIM 253300）最為嚴(yán)重，于出生后6個(gè)月內(nèi)發(fā)病，患兒全身嚴(yán)重肌無力及肌張力減退，無法坐立，呼吸及吞咽功能降低，常在2歲前死于呼吸肌麻痹；Ⅱ型SMA（MIM 253550）起病稍晚，在出生后6～18個(gè)月內(nèi)發(fā)病，患兒能坐但無法站立和行走，存活期限視呼吸肌受累的程度而定，一般都超過2歲；Ⅲ型（又稱庫格爾貝格-韋蘭 德 病，Kugelberg-Welander disease，MIM 253400），于出生18個(gè)月后發(fā)病，患兒能獨(dú)立行走，病情進(jìn)展緩慢，可存活至成年，但通常需要借助輪椅生活。

SMA是常染色體隱性遺傳性疾病，多數(shù)患兒父母雙方都為無癥狀的SMA攜帶者，每次生育時(shí)都有25%的風(fēng)險(xiǎn)概率生育SMA患兒。

2 SMA分子機(jī)理

3種亞型的SMA都與5號染色體長臂5q11.2-13.3的SMN基因相關(guān)。SMN基因有2個(gè)反向重復(fù)拷貝，端粒側(cè)的稱為SMN1，著絲粒側(cè)的稱為SMN2，二者高度同源，基因組序列只有5個(gè)堿基位點(diǎn)的差異，其中2個(gè)位于7號和8號外顯子上，3個(gè)分別位于第6、7號內(nèi)含子內(nèi)。

目前已公認(rèn)，SMN1基因是SMA主要的致病基因。雖然SMN2序列上與之高度相似，但是位于7號外顯子上關(guān)鍵的C→T堿基差異（c.840C＞T），造成SMN2基因轉(zhuǎn)錄后的剪切改變，致使SMN2表達(dá)的蛋白缺少由第7號外顯子編碼的核心功能區(qū)域。完整的SMN1蛋白包含294個(gè)氨基酸，分子量為38-KDa，在富含尿嘧啶的小核核糖核蛋白（SnRNP）的形成過程中起著重要作用。

SMN1兩個(gè)等位基因同時(shí)突變是造成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型SMA的主要原因，95%的患者為SMN1純合缺失所致，基因的缺失與同源序列造成的基因組重排相關(guān)［2］，其余5%是雜合缺失［3］，即一個(gè)等位基因缺失，另一個(gè)發(fā)生了突變。越來越多的研究表明，SMN1突變類型與疾病的臨床分型沒有內(nèi)在聯(lián)系，而患者體內(nèi)殘留的SMN2拷貝數(shù)與疾病的嚴(yán)重程度成負(fù)相關(guān)，可能與SMN2部分代償SMN1的正常功能有關(guān)。

3 SMA分子診斷方法

3.1 PCR-RFLP（PCR-Fragment Length Polymerase PCR-限制性片段長度多態(tài)性分析） PCR-RFLP是目前最常用的臨床SMA診斷的方法，可以確認(rèn)由SMN1的7號外顯子純合缺失導(dǎo)致的SMA患兒。利用SMN1和SMN2 7號外顯子和8號外顯子上的堿基差異，設(shè)計(jì)特異性引物在此處，可以特異性擴(kuò)增SMN1或SMN2，并引入相應(yīng)的酶切位點(diǎn)DraI［4］或HinfI［5］，前者7號外顯子下游引物設(shè)計(jì)在SMN1和SMN2的特異性差異堿基處，設(shè)計(jì)在7號外顯子上，可以特異性地將患兒僅存的SMN2 7號外顯子切開為2條帶，而沒有總長188bp的SMN1全長，而正常人不僅有188bp的SMN1全長，PAGE電泳后還可見有164bp的切開的SMN2全長。用HinfI酶切時(shí)，上游引物設(shè)計(jì)在SMN1和SMN2的特異性差異堿基處，引物主要位于7號外顯子前端的內(nèi)含子保守區(qū)。正常人的SMN1會被切開為75 bp和26bp的2條帶，還有一條無法切開的101bp的SMN兩條帶，而患兒只有101bp的SMN兩條帶。在中國人群的臨床檢測中，宋昉等［4］對338例臨床疑似SMA患兒進(jìn)行PCR-RFLP分析發(fā)現(xiàn)有267例為純合缺失，而另外還有88例中有17例符合SMA國際診斷標(biāo)準(zhǔn)，另外71例后期評估發(fā)現(xiàn)非SMA疾病，17例經(jīng)MLPA驗(yàn)證為雜合缺失；季星等［7］對85例臨床疑似SMA患兒進(jìn)行PCR-RFLP分析發(fā)現(xiàn)有57例純合缺失，另外19例陰性患兒在后期隨訪后發(fā)現(xiàn)15例不符合SMA的診斷。由此可見，SMA的臨床表征比較復(fù)雜，易于和其他神經(jīng)肌肉和遺傳代謝病混淆，而且SMA的診斷如果單一依靠PCR-RFLP容易造成漏診誤診，而且如果單一地將PCR-RFLP應(yīng)用于產(chǎn)前診斷，由于無法判斷

母源污染情況而存在一定的假陰性率。

3.2 STR連鎖分析 STR連鎖分析是一種間接的診斷SMA的方法，只能針對有先證者的家系進(jìn)行分析。目前，國內(nèi)已有多項(xiàng)采用STR連鎖分析配合PCR-RFLP進(jìn)行SMA產(chǎn)前診斷的報(bào)道，但大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室都是直接選用國外文獻(xiàn)中的STR位點(diǎn)，并未根據(jù)漢族人群的特點(diǎn)和STR多態(tài)性信息的差異在漢族人群中重新進(jìn)行選擇，而且大多采用傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）進(jìn)行分析。孫維等［5］在30名正常漢族人群中對常用的STR位點(diǎn)重新進(jìn)行了多態(tài)性分析，選出了適合中國人群的STR位點(diǎn)。

此外，由于SMA遺傳的復(fù)雜性，正常人群中會有部分“2+0”型攜帶者，為了區(qū)分“2+0”型和“1+1”型，也可以選用和SMN1、SMN2緊密連鎖的STR位點(diǎn)，在有2個(gè)以上后代的家系中進(jìn)行連鎖分析，確認(rèn)SMN1基因型狀況。這里常用的位點(diǎn)為多拷貝STS位點(diǎn)C212和C272，盡管這2個(gè)位點(diǎn)的結(jié)果判定比較復(fù)雜［8］。

3.3 SMN1點(diǎn)突變分析 因?yàn)镾MA疾病發(fā)病復(fù)雜，點(diǎn)突變比例相對較小，檢測費(fèi)時(shí)費(fèi)力，所以SMN1的點(diǎn)突變分析目前還沒有進(jìn)入到SMA患兒的常規(guī)臨床檢測中。目前點(diǎn)突變檢測的常用方法有：①以基因組DNA為模板，跨SMN1 7～8個(gè)外顯子設(shè)計(jì)特異性引物，進(jìn)行長程PCR，可長達(dá)13kb，然后進(jìn)行亞克隆或者巢氏PCR，擴(kuò)增SMN1各個(gè)外顯子進(jìn)行測序以發(fā)現(xiàn)點(diǎn)突變［9，10］；②如果可以得到患者的新鮮外周血，或者已經(jīng)對患者進(jìn)行了淋巴細(xì)胞建株，可以提取患者RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，特異性擴(kuò)增SMN1各個(gè)外顯子進(jìn)行測序［11］，但該方法只能發(fā)現(xiàn)外顯子區(qū)的點(diǎn)突變，對于外顯子和內(nèi)含子連接區(qū)的剪切位點(diǎn)突變就需要借助其他方法；③如果以上2種情況都行不通，那么只能直接以患者的基因組DNA為模板，擴(kuò)增SMN各個(gè)外顯子，此法無法區(qū)分所擴(kuò)片段是否是SMN1片段，所以即使發(fā)現(xiàn)了點(diǎn)突變，也需要后期的進(jìn)一步印證［12］。

3.4 SMN1拷貝數(shù)分析 由于PCR-RFLP對點(diǎn)突變SMA患者無法檢出且操作較復(fù)雜，故可以首先進(jìn)行SMN1拷貝數(shù)分析，對SMN1拷貝數(shù)為0的判定為患者，為單拷貝的再進(jìn)行點(diǎn)突變分析。這樣不僅可以檢出SMA患者，而且也可以區(qū)分正常人和SMA攜帶者［13］。在產(chǎn)前診斷中，結(jié)合SMN1拷貝數(shù)分析技術(shù)和STR連鎖分析技術(shù)，還可以檢出‘2+0’型攜帶者。因此，SMN1拷貝數(shù)分析是現(xiàn)有SMA基因診斷和產(chǎn)前診斷技術(shù)的有益補(bǔ)充，在SMA診斷中可以進(jìn)一步診斷5%的非SMN1純合缺失導(dǎo)致的SMA患者；在產(chǎn)前診斷中，不僅可以應(yīng)用在有先證者家系的快速產(chǎn)前診斷中，而且對無先證者家系的產(chǎn)前診斷可以提供一條途徑。

4 SMA攜帶者篩查

4.1 SMA攜帶者篩查方法 1997年，McAndrew等首先利用基因組內(nèi)CFTR基因4號外顯子作為內(nèi)對照，對SMN1和SMN2拷貝數(shù)進(jìn)行了定量分析，區(qū)分了SMA攜帶者和正常人。近幾年發(fā)展的SMN1拷貝數(shù)分析方法很多，包括多重連接依賴的探針擴(kuò)增技術(shù)（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA），變性高效液相法（denaturing high-performance liquid chromatography，DHPLC）和基于 TaqMan熒光探針［14］和SYBR熒光染料［15］檢測的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)。幾種方法各有利弊，目前也都有應(yīng)用在各國人群的大規(guī)模篩查中。

4.1.1 多重連接依賴的探針擴(kuò)增技術(shù)MLPA（multiplex ligation-dependent probe amplification）

MLPA于2002年由Schouten等首先報(bào)道，是近幾年發(fā)展起來的一種針對待檢DNA序列進(jìn)行定性和半定量分析的新技術(shù)。該技術(shù)高效、特異，在一次反應(yīng)中可以檢測多達(dá)50個(gè)不同位點(diǎn)的核苷酸序列拷貝數(shù)改變。它的左右探針包括一段特異性的引物和一段通用引物，在一次反應(yīng)中探針首先和靶序列DNA進(jìn)行雜交，然后2個(gè)探針用連接酶連接。連接反應(yīng)高度特異，只有當(dāng)探針與靶序列完全互補(bǔ)，連接酶才能將2段探針連接成一條完整的核酸單鏈。連接反應(yīng)完成后，用一對通用引物擴(kuò)增連接好的探針子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物通過毛細(xì)管電泳分離，然后用分析軟件對收集的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析最后得出結(jié)論。MLPA方法目前已經(jīng)應(yīng)用于多種疾病的缺失或擴(kuò)增檢測，如染色體三體征、乳腺癌、結(jié)腸癌和杜氏肌營養(yǎng)不良［16-18］等。

MLPA用于SMA攜帶者的篩查相對來講是一個(gè)比較成熟的方法，已經(jīng)有成熟的商用試劑盒（SALSA MLPA KIT P021 ）供應(yīng)［19］。該試劑盒的檢測探針左右連接位點(diǎn)設(shè)計(jì)在SMN1／SMN2第7和第8號外顯子差異堿基處，同時(shí)還在其他染色體上設(shè)計(jì)有多處內(nèi)參探針。通過比較待檢樣本與對照樣本間待檢位點(diǎn)與內(nèi)參位點(diǎn)探針擴(kuò)增的效率比值（relative peak area，RPA），即可對SMN1和SMN2基因組拷貝數(shù)進(jìn)行半定量分析。Ben-Shachar等［19］的研究顯示，采用MLPA進(jìn)行SMA攜帶者篩查，人群中SMN1的RPA值呈連續(xù)分布，雖然RPA值在0.5、1.0和1.5（對應(yīng)于SMN1基因?yàn)?個(gè)、2個(gè)和3個(gè)拷貝）處各有一個(gè)人群分布高峰，但3個(gè)峰值間沒有明顯分隔。如果將區(qū)分SMN1拷貝數(shù)為1的SMA攜帶者閾值從0.7調(diào)到0.75，就會使12人被重新劃為攜帶者。因此研究者建議，將這種方法用于人群攜帶者研究，閾值的確立需慎重考慮。

4.1.2 變性高效液相法DHPLC 變性高效液相色譜（DHPLC）是一項(xiàng)在單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）和變性梯度凝膠電泳（DGGE）基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新的雜合雙鏈突變檢測技術(shù)，可自動(dòng)檢測單堿基替代及小片段核苷酸的插入或缺失。利用DHPLC進(jìn)行SMA攜帶者篩查時(shí)，目的基因SMN1、SMN2和內(nèi)參基因經(jīng)擴(kuò)增、變性、復(fù)性處理后同時(shí)上DHPLC色譜柱，然后以不同濃度的乙氰梯度洗脫分離，紫外分光光度計(jì)檢測各擴(kuò)增產(chǎn)物濃度，經(jīng)特定軟件分析目的基因和內(nèi)參基因產(chǎn)物濃度比值后即得目的基因拷貝數(shù)的相對比值。為保證不同基因產(chǎn)物濃度的可比性，擴(kuò)增模板量需保持一致，基因擴(kuò)增采用多重PCR的方法。然而在多重PCR時(shí)，不同引物間配比濃度的微小差異都會影響靶標(biāo)基因的擴(kuò)增效率，從而造成不同批次分析結(jié)果的差異［20，21］。Lee等［20］就曾報(bào)道，采用DHPLC篩查SMA攜帶者，部分樣本的結(jié)果不能區(qū)分是SMN1∶SMN2=2∶3的正常型還是SMN1∶SMN2=1∶2的攜帶者型；亦或是SMN1∶SMN2=2∶2的正常型還是SMN1∶SMN2=1∶1的攜帶者。所以研究者建議用DHPLC的方法進(jìn)行初篩，然后用其他方法進(jìn)行驗(yàn)證［20，22］。

4.1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù) TaqMan熒光探針：基于特異性的TaqMan熒光探針技術(shù)，在PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針——一種寡核苷酸探針，兩端分別標(biāo)記一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)和一個(gè)淬滅基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，探針被Taq酶的5′—3′外切酶活性降解，使熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離，從而可以通過實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程熒光信號的積累，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比進(jìn)行定量分析。

SYBR熒光染料：在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，其能特異性地?fù)饺隓NA雙鏈的小溝，發(fā)射熒光信號。而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射熒光信號，這就保證了熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。當(dāng)PCR循環(huán)復(fù)制時(shí)DNA雙鏈也成倍增長，同樣SYBR染料的熒光信號也隨之增倍。通過實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程中熒光信號的積累，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比進(jìn)行定量分析。

4.2 SMA攜帶者頻率 在歐洲，脊髓肌肉萎縮癥是繼囊性纖維癥之后的第二大常染色體隱性遺傳病，它也是使嬰兒致死的主要遺傳性原因之一。攜帶者頻率在不同的人群中為1／35～1／168［12，14，19，23］。在歐美國家基于大規(guī)模人群研究的攜帶者篩查已經(jīng)開展了許多。數(shù)據(jù)比較大的有如最近以色列的一篇報(bào)道［19］，在6394名無家族史的正常人群中，篩查出了159名攜帶者，比例為1／40；將美國的各個(gè)亞族統(tǒng)計(jì)在一起的話，則攜帶者比例為1／59（87／5104）［14］；韓國在326名正常人中篩選出了7名攜帶者，攜帶者比例為1／47［15］；其他還有葡萄牙1／52［24］，澳大利亞1／49［25］，德國1／50～1／60［26］和伊朗1／20［27］。在中國，共有 4 篇報(bào)道［11，12，23，28］，分別是香港地區(qū)基于569人的研究，得出了1／63的攜帶率；以廣東地區(qū)居民為主的研究得出的攜帶率為1／42（41／1712），以上海地區(qū)居民為主的研究得出的攜帶率為1／39（45／1741）［12］；而最近規(guī)模最大的研究要數(shù)中國臺灣地區(qū)為時(shí)4年的基于107 611位育齡產(chǎn)婦的研究，共檢出單拷貝SMN1育齡女性2262人，攜帶率為1／48；之后對檢出的攜帶者配偶進(jìn)行SMN1拷貝數(shù)分析，檢出47對夫婦屬于高風(fēng)險(xiǎn)家系，對其中的43個(gè)家庭進(jìn)行產(chǎn)前診斷，檢出了12名SMA患兒。

4.3 SMA攜帶者篩查后的遺傳咨詢風(fēng)險(xiǎn)評估 自從SMA疾病的致病基因定位以來，SMA遺傳咨詢?nèi)〉昧撕艽蟮倪M(jìn)步。SMA疾病的全面檢測，包括PCR-RFLP、SMN1拷貝數(shù)分析和連鎖分析，以及合適的遺傳風(fēng)險(xiǎn)評估和遺傳咨詢，對SMA病人和家庭提供了全面的評估。SMA的風(fēng)險(xiǎn)評估和遺傳咨詢是SMA遺傳檢測中的一個(gè)不可或缺的組成部分。由于人群中‘2+0’型攜帶者的存在，SMN拷貝數(shù)分析不能檢測出所有攜帶者，在臨床檢測中對于大于2拷貝SMN1的個(gè)體進(jìn)行適當(dāng)?shù)娘L(fēng)險(xiǎn)評估就顯得尤為重要。有研究表明，人群中還可能存在‘3+0’型攜帶者［12，29］，因此對拷貝數(shù)大于2的多拷貝數(shù)有必要進(jìn)一步區(qū)分，以獲得2-拷貝和3-拷貝等位基因的準(zhǔn)確頻率，因?yàn)閮烧叩臄y帶者風(fēng)險(xiǎn)有很大的差異。然而，我們知道遺傳風(fēng)險(xiǎn)評估也只是一個(gè)預(yù)估，這些數(shù)據(jù)的得出是基于在特定人群中有限的病例中得到的數(shù)據(jù)。因此，對于進(jìn)行遺傳咨詢的家系，額外的家庭成員的信息，尤其是有關(guān)SMA疾病相關(guān)方面的信息，對得到精確的遺傳風(fēng)險(xiǎn)評估非常重要。

5 總 結(jié)

綜上所述，SMA的分子基礎(chǔ)明確，有完善和系統(tǒng)的檢測手段，因此可以對有遺傳史的家系進(jìn)行產(chǎn)前診斷以規(guī)避再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，降低社會負(fù)擔(dān)。由于SMA的攜帶率高達(dá)1／35～1／168，到目前為止還沒有行之有效的治療方法。目前在以色列、中國臺灣、美國等國家及地區(qū)SMA攜帶者篩查已經(jīng)進(jìn)入臨床常規(guī)篩查，而且這些篩查結(jié)果提示不同的人群，不同的種族SMA攜帶者頻率存在一定的差異，因此，在我國開展人群SMA攜帶者篩查有著迫切的需求。首先，我國人口基數(shù)大，攜帶者數(shù)量巨大，他們具有潛在的傳遞致病基因和生育SMA患兒的風(fēng)險(xiǎn)；其次SMA疾病本身臨床癥狀比較嚴(yán)重，病死率高，社會和家庭負(fù)擔(dān)沉重；三是攜帶者篩查是降低SMA發(fā)病率的惟一有效途徑。此外，在我國人群中常規(guī)開展SMA攜帶者篩查項(xiàng)目意義重大，一方面，可以建立中國人群的SMA攜帶者頻率數(shù)據(jù)和各基因型頻率數(shù)據(jù)及SMA人群干預(yù)的衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)學(xué)數(shù)據(jù)；另一方面，更重要的是早期發(fā)現(xiàn)隱性基因攜帶者，為遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷提供據(jù)，進(jìn)行有效的產(chǎn)前診斷和干預(yù)，完善疾病的預(yù)防體系，從而最終降低中國人群SMA的發(fā)病率。

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