張勝利 朱寶生

（昆明醫(yī)科大學(xué)，云南省第一人民醫(yī)院 遺傳診斷中心，云南 昆明 650032）

出生缺陷是影響出生人口素質(zhì)的重要問題，其會(huì)給社會(huì)和家庭帶來沉重負(fù)擔(dān)，而中國又是出生缺陷高發(fā)國家，降低出生缺陷人口的出生率尤為重要。隨著全國出生缺陷監(jiān)測(cè)能力的提高，以醫(yī)院為基礎(chǔ)的出生缺陷監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)由1996年的87.7萬上升到2010年的149.9萬，增長幅度達(dá)70.9%［1］。產(chǎn)前診斷是預(yù)防出生缺陷的重要措施，傳統(tǒng)的產(chǎn)前診斷方法如絨毛活檢取樣、羊膜腔穿刺、臍血穿刺等均為介入性操作，這些操作的潛在風(fēng)險(xiǎn)，如流產(chǎn)、感染、致畸等，給孕婦和家人帶來一定的精神壓力，且由于其創(chuàng)傷性的存在也使得產(chǎn)前診斷只在有限的人群范圍內(nèi)進(jìn)行，這些風(fēng)險(xiǎn)的存在也帶來一定的醫(yī)療隱患。非侵入性的產(chǎn)前檢查方法，如血液或超聲檢查的檢測(cè)范圍局限，不能作為診斷去解決病人存在的問題。而母血漿中胎兒游離DNA的發(fā)現(xiàn)，極大促進(jìn)了非侵入性產(chǎn)前診斷的研究，成為近年產(chǎn)前診斷研究的熱點(diǎn)。本文對(duì)胎兒游離DNA在非侵入性產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用作一綜述。

1 孕婦血漿中胎兒游離DNA的發(fā)現(xiàn)、來源、特征及清除機(jī)制

1.1 孕婦血漿中胎兒游離DNA的發(fā)現(xiàn) 1969年Walknowska等人發(fā)現(xiàn)孕男胎的婦女外周血中含有46，XY細(xì)胞，證實(shí)了孕婦外周血中確實(shí)存在胎兒細(xì)胞，但由于檢測(cè)成本高、技術(shù)繁瑣，而且母外周血中的胎兒細(xì)胞數(shù)量極少，限制了大規(guī)模臨床應(yīng)用。1996年Chen等首次在肺癌患者血漿和血清中檢測(cè)到腫瘤特異性DNA序列。由于胎兒和腫瘤在生物學(xué)上存在著相似性，受此啟發(fā)，1997年，Lo等［2］在孕男胎孕婦外周血漿及血清提取的DNA中擴(kuò)增出Y染色體特異性序列，首次證明妊娠婦女外周血的血漿及血清中存在著穩(wěn)定的游離胎兒DNA（cell-free fetalDNA，cffDNA），在孕早期和孕晚期分別占血漿總DNA的3.4%和6.2%［3］，其他實(shí)驗(yàn)室也有研究報(bào)道cffDNA大約占總游離DNA的10%～20%［4］。

1.2 孕婦血漿中cffDNA的來源 目前認(rèn)為孕婦外周血中cffDNA的來源有以下幾種可能的機(jī)制：①胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞源性學(xué)說［5］，該觀點(diǎn)認(rèn)為，胎兒DNA來源于滋養(yǎng)層細(xì)胞，孕4周時(shí)滋養(yǎng)層間隙被母血充盈，合體滋養(yǎng)層細(xì)胞可直接滲透入母血，激活母體免疫系統(tǒng)，破壞胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞，導(dǎo)致胎兒DNA直接進(jìn)入母血循環(huán)，此時(shí)胎盤形成，但胎盤循環(huán)未建立，cff DNA的出現(xiàn)證明胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞是母血漿中胎兒DNA的最初來源，在母體血漿中檢測(cè)出了胎盤特異mRNA及胎盤來源的母胎差異性甲基化［6］（cff DNA更加證明了此學(xué)說）。②胎兒有核細(xì)胞破壞凋亡學(xué)說，該說認(rèn)為cff DNA來源于進(jìn)入孕婦外周血中的胎兒有核細(xì)胞的破壞和凋亡，胎兒細(xì)胞通過胎盤進(jìn)入到母血中，被母體免疫系統(tǒng)破壞，cff DNA殘留下來。研究證實(shí)，在孕婦血漿中，存在胎兒有核紅細(xì)胞的凋亡，且有證據(jù)表明，cff DNA具有凋亡DNA片段的一些特征。③胎盤通道學(xué)說，該學(xué)說認(rèn)為，在胎兒發(fā)育過程中，胎兒細(xì)胞凋亡后釋放出的DNA通過胎盤運(yùn)輸?shù)皆袐D外周血中。Sekizawa等［7］研究發(fā)現(xiàn)母胎界面為雙向性通道，母胎之間的游離DNA（cell-free，cf DNA）可以通過胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)。④還有學(xué)說認(rèn)為，孕婦血漿中cff DNA來自于不同胎兒組織的DNA釋放入羊水中，再通過胎盤和羊膜腔的直接彌散作用進(jìn)入母血中［8］。目前關(guān)于cff DNA的來源尚沒有肯定的解釋，以上幾種學(xué)說都有其證據(jù)存在，所以其來源有待深層次研究。

1.3 孕婦血漿cff DNA的特征 研究表明cff DNA具有細(xì)胞凋亡的生化特性，即基因組DNA的片斷化。研究表明［9］孕婦血漿中cf DNA 分子大于201bp的占57%，胎源性cf DNA分子中80%片段長度在193bp以下，大于303bp的為0。新近研究報(bào)道［10］胎源性cf DNA的平均最大片段長度為286bp，并推論其是由≤2個(gè)核小體組成。目前對(duì)此現(xiàn)象尚無確切解釋，但此類發(fā)現(xiàn)使cff DNA分離和檢測(cè)更進(jìn)一步，在進(jìn)行無創(chuàng)性產(chǎn)前分子基因診斷中也有重要意義。

1.4 孕婦血漿cff DNA的清除機(jī)制 母血中cff DNA半衰期為16.3（4～30）分鐘，在產(chǎn)后2小時(shí)后絕大多數(shù)產(chǎn)婦檢測(cè)不到循環(huán)的胎兒cff DNA。因此，以母血中cff DNA為產(chǎn)前基因診斷研究的對(duì)象可以避免前次妊娠殘留有胎兒DNA而影響本次妊娠的分析結(jié)果。Illanes等［11］的數(shù)據(jù)表明腎臟在血漿DNA清除中起主要作用，而這一結(jié)果也使其發(fā)現(xiàn)了尿中存在游離胎兒DNA的事實(shí)，為無創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷提供了新的選擇。此外，母體血液中的血漿核酸酶、肝臟、腎臟對(duì)游離DNA也具有一定的清除作用。

2 血漿中胎兒DNA的檢測(cè)

2.1 生物學(xué)標(biāo)記物的發(fā)展 最早，通過男胎父源性的Y染色體特異序列的檢測(cè)作為cff DNA存在的標(biāo)記物，這就使得對(duì)孕婦外周血胎源DNA的應(yīng)用局限在檢測(cè)的胎兒遺傳物質(zhì)必須能與母親遺傳物質(zhì)顯著區(qū)分開來，即胎兒從父方繼承來的基因或突變，這種限制使得對(duì)cffDNA存在的檢測(cè)及從母親遺傳的等位基因的檢測(cè)陷入困境，因而大大限制了cff DNA在產(chǎn)前診斷領(lǐng)域的應(yīng)用。

有研究者［12］根據(jù)母胎游離DNA分子大小的差異，通過電泳法和過柱法分離和富集cff DNA，并與其他技術(shù)結(jié)合用于后續(xù)檢測(cè)。這一技術(shù)方案已被認(rèn)為是相對(duì)可靠的，但分離純化過程中可能存在樣本的污染。還有研究集中在短串聯(lián)重復(fù)序列（STRs）和單核苷酸多態(tài)性（SNPs）多態(tài)性上。鄧志輝等［13］通過擴(kuò)增片段長度較小多態(tài)性豐富的MiniSTR等位基因座，檢測(cè)胎兒cff DNA，結(jié)果在9例孕婦血漿樣本中檢測(cè)到父源性STR等位基因。Dhallan等［14］建立了通過單核苷酸多態(tài)性（SNPs）區(qū)分胎兒DNA和孕母DNA并診斷胎兒染色體的數(shù)目的方法。在SNP的基礎(chǔ)上采用單等位基因堿基延伸反應(yīng)用于非侵入性產(chǎn)前診斷也有研究［15］。這些方法已取得一些進(jìn)展但仍有其局限性，由于方法較復(fù)雜且受到基因多態(tài)性的影響，尚未大規(guī)模應(yīng)用于臨床。

在表觀遺傳學(xué)方面也有突破，自Chim等研究證實(shí)，maspin基因在胎盤細(xì)胞中處于低甲基化狀態(tài)，而在母血細(xì)胞中處于高甲基化狀態(tài)后，Chan等［16］也發(fā)現(xiàn)了位于3號(hào)染色體的RASSF1A基因在母血細(xì)胞和胎盤間有著不同的甲基化形式。利用母胎cf DNA甲基化的差異，既可以突破母血漿中檢測(cè)cffDNA的局限性，也可進(jìn)行其他疾病的檢測(cè)。Papageorgiou等［17］利用21號(hào)染色體上的母胎基因甲基化程度的差異，分析母胎21號(hào)染色體比例來檢測(cè)21三體胎兒。隨著表觀遺傳學(xué)的發(fā)展，應(yīng)用DNA甲基化差異進(jìn)行非侵入性產(chǎn)前診斷的方法得到不斷應(yīng)用［18］。

2.2 相關(guān)檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步 由于孕婦血中胎兒游離DNA絕對(duì)量極其微少，需要采用非常敏感的方法才能獲得穩(wěn)定可靠的檢測(cè)結(jié)果，而PCR技術(shù)的發(fā)展使微量的胎兒DNA的檢測(cè)成為可能。但由于傳統(tǒng)的PCR實(shí)驗(yàn)方法的局限性不能滿足臨床的需求，所以新的檢測(cè)技術(shù)方法不斷被應(yīng)用。

2.2.1 肽核酸 肽核酸（peptide-nucleic acid，PNA）是一類新的信息分子，其以比普通核酸更高的親和力及特異性與DNA或RNA雜交，形成具有高度熱穩(wěn)定性的復(fù)合體，來封閉母源性野生型模板，而另一組檢測(cè)突變的DNA引物參與父源性突變位點(diǎn)序列的PCR擴(kuò)增。

2.2.2 飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù) 由于母源性和胎源性的游離DNA的長度分布差異，應(yīng)用飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)，2種來源的DNA電離狀態(tài)的存在差異，在電場(chǎng)作用下分子通過飛行管道到達(dá)檢測(cè)器的飛行時(shí)間不同，進(jìn)而區(qū)分2種來源的DNA。

近年來發(fā)展的基質(zhì)輔助激光解析電力飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)是一種新型的質(zhì)譜技術(shù)，其特點(diǎn)是在基質(zhì)中軟電離不會(huì)把分子打碎，可以檢測(cè)混合物，靈敏度高，其檢測(cè)效果類似于父源性等位基因得到了“提純”或富集，產(chǎn)生的檢測(cè)圖譜非常清晰。該技術(shù)已成為目前國際上母體血漿胎兒核酸突變分析的重要技術(shù)。但是其存在成本高、耗時(shí)長、步驟繁瑣、實(shí)驗(yàn)條件要求高等問題。

2.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)（QPCR）

在PCR反應(yīng)體系中加入熒光集團(tuán)利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析。該技術(shù)結(jié)合其他技術(shù)在非侵入性產(chǎn)前診斷中有較廣應(yīng)用。

2.2.4 數(shù)字化PCR 數(shù)字PCR技術(shù)（digital PCR，dPCR）是將樣本處理至單目標(biāo)分子后，同時(shí)獨(dú)立行PCR反應(yīng)，從而對(duì)樣本進(jìn)行絕對(duì)定量檢測(cè)。后經(jīng)過不斷改良，發(fā)展出了BEAMing技術(shù)和微液數(shù)字PCR技術(shù)，檢測(cè)反應(yīng)更多更全，極大推進(jìn)了該技術(shù)的臨床應(yīng)用可行性。Lun等［19］對(duì)實(shí)時(shí)熒光PCR、質(zhì)譜、微液數(shù)字PCR這3項(xiàng)技術(shù)進(jìn)行了對(duì)比分析后，證實(shí)微液數(shù)字PCR技術(shù)具有最佳的穩(wěn)定性和定量準(zhǔn)確性。微液數(shù)字PCR技術(shù)無論在定性還是定量檢測(cè)方面都具有快速、準(zhǔn)確、靈敏、特異等諸多優(yōu)點(diǎn)，是一項(xiàng)十分適用于母血中胎兒游離DNA檢測(cè)的技術(shù)。雖然目前其操作成本較高，但是相信隨著技術(shù)領(lǐng)域的不斷突破，微液數(shù)字PCR有望成為分子診斷實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)技術(shù)［20］。

2.2.5 大規(guī)模平行基因組測(cè)序 該技術(shù)對(duì)全基因組進(jìn)行分析，不依賴于單個(gè)位點(diǎn)，能同時(shí)進(jìn)行上億個(gè)測(cè)序反應(yīng)。對(duì)孕婦血漿中cf DNA進(jìn)行測(cè)序，得到的堿基序列與人類基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，通過生物信息統(tǒng)計(jì)分析來檢測(cè)疾病。

在非侵入性產(chǎn)前診斷的過程中，以上各種生物學(xué)標(biāo)記物及檢測(cè)技術(shù)的相互結(jié)合，相互促進(jìn)，使非侵入性產(chǎn)前診斷技術(shù)不斷進(jìn)步與完善。

3 孕婦血漿中胎兒游離DNA的臨床應(yīng)用研究

母血中cff DNA的在產(chǎn)前診斷方面的應(yīng)用主要分為兩方面，包括對(duì)胎兒DNA質(zhì)的檢測(cè)和胎兒DNA量的測(cè)定。質(zhì)的檢測(cè)是通過檢測(cè)胎兒DNA某些致病基因的存在或?qū)δ承┬匀旧w連鎖疾病或者其他疾病進(jìn)行產(chǎn)前診斷。而有些疾病可以引起游離胎兒DNA量的異常，對(duì)胎兒游離DNA量的檢測(cè)可以及早發(fā)現(xiàn)疾病的存在，及早進(jìn)行控制和治療。目前，游離胎兒DNA已經(jīng)用于性別鑒定及性染色體連鎖疾病、胎兒Rh系統(tǒng)基因型的檢測(cè)、妊娠相關(guān)疾病、胎兒染色體病、胎兒染色體片段異常、父系單基因遺傳病等的產(chǎn)前診斷研究中。

3.1 性別鑒定及X連鎖遺傳病 目前X連鎖遺傳病有200多種，常見的有肌營養(yǎng)不良、血友病、先天性腎上腺皮質(zhì)增生等，對(duì)此類疾病，性別鑒定有著重要的優(yōu)生優(yōu)育意義。既往臨床早期產(chǎn)前性別診斷存在流產(chǎn)和致畸風(fēng)險(xiǎn)，不易被孕婦接受，而母血中胎兒DNA在性別遺傳鑒定方面的研究開展較早、準(zhǔn)確也有其優(yōu)勢(shì)所在。Mohamad等［21］用mini-STR和熒光定量PCR兩種方法，在早孕期分別檢測(cè)母血漿胎兒游離DNA的Y染色體的特異性序列，結(jié)果顯示兩種方法的敏感性和特異性分別為95.9% 、98%和91.8% 、100%。近期，一項(xiàng)綜合分析了90個(gè)研究中心的10 587名胎兒性別鑒定的結(jié)果顯示［22］，用母血漿胎兒游離DNA結(jié)合多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)對(duì)胎兒性別鑒定的平均敏感性為96.6%，特異性為98.9%。利用胎兒游離DNA進(jìn)行性別鑒定其準(zhǔn)確性已經(jīng)得到極大驗(yàn)證，這樣只需對(duì)孕男胎的婦女行進(jìn)一步的創(chuàng)傷性產(chǎn)前基因診斷即可，避免了對(duì)孕女胎婦女行創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷而導(dǎo)致的不必要的流產(chǎn)致畸風(fēng)險(xiǎn)。雖然這些研究的準(zhǔn)確性已較滿意，但是對(duì)于仍可能存在的假陰性及假陽性的情況，研究者有采用STR的方法檢測(cè)X染色體上的位點(diǎn)來進(jìn)一步診斷女性胎兒，還有采用檢測(cè)常染色體上的通用標(biāo)記物來作為陽性對(duì)照，確定胎源性物質(zhì)的存在［23］。無創(chuàng)產(chǎn)前性別鑒定對(duì)X連鎖遺傳病的診斷有較高的臨床價(jià)值，其高準(zhǔn)確性可降低侵入性產(chǎn)前診斷的使用率，進(jìn)而減少流產(chǎn)和畸形的發(fā)生。

3.2 胎兒Rh系統(tǒng)基因型 RhD陰性的孕婦如有RhD陽性胎兒孕產(chǎn)史，則以后生育均可能引起胎兒紅細(xì)胞的破壞進(jìn)而出現(xiàn)嚴(yán)重的貧血，還可引起新生兒溶血、心力衰竭、核黃疸甚至死亡。雖然Rh D陰性的發(fā)生率在不同人種中有所不同，但對(duì)于Rh D陰性的孕婦進(jìn)行胎兒產(chǎn)前的Rh D血型檢測(cè)仍是非常有必要的。這項(xiàng)檢測(cè)可使孕Rh D陰性胎兒免于進(jìn)行不必要的主動(dòng)免疫治療，而使孕Rh D陽性胎兒能夠及早地選擇主動(dòng)免疫治療或終止妊娠，為其臨床推廣應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。傳統(tǒng)的介入性產(chǎn)前診斷存在母胎出血、刺激抗體產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)，所以非侵入性產(chǎn)前診斷就更凸顯出它的優(yōu)勢(shì)。Brojer等［24］對(duì)230例Rh D陰性的孕婦進(jìn)行研究，擴(kuò)增Rh D基因的第4內(nèi)含子、第7和第10外顯子，準(zhǔn)確率達(dá)99%。自2001年起，國際血型參比實(shí)驗(yàn)室英國國家血液中心將利用孕婦血漿游離DNA進(jìn)行胎兒RhD的基因分型作為常規(guī)檢查項(xiàng)目，這是首個(gè)臨床開展的以DNA為基礎(chǔ)的非侵入性產(chǎn)前診斷常規(guī)項(xiàng)目，此后，法國和荷蘭也將此列入常規(guī)項(xiàng)目。而Rh系統(tǒng)的c、E、K基因型的檢測(cè)也通過此方法得到應(yīng)用。Scheffer等［25］用熒光定量PCR技術(shù)，共對(duì)362名有檢測(cè)指征的孕婦進(jìn)行Rh系統(tǒng)基因型的檢測(cè)（RhD168例、Rhc49例、RhE85例、Rh K 60例），其中351例（97%）得到檢測(cè)結(jié)果，且該部分無假陰性及假陽性結(jié)果存在，另11例由于胎兒游離DNA含量低及其他原因?qū)е聼o檢測(cè)結(jié)果。采用非侵入性產(chǎn)前診斷技術(shù)對(duì)胎兒Rh系統(tǒng)基因型進(jìn)行預(yù)測(cè)有較高的敏感性及特異性，可作為應(yīng)用于臨床的診斷技術(shù)。

3.3 妊娠相關(guān)疾病 研究發(fā)現(xiàn)很多妊娠相關(guān)疾病存在胎兒游離DNA濃度的異常升高［26］，例如早產(chǎn)、胎兒宮內(nèi)生長受限、羊水過多、侵入性胎盤、胎死宮內(nèi)、妊娠劇吐等，研究最多的是先兆子癇的異常變化，其可能的病理原因，一方面由于子癇前期胎盤通透性增加，可導(dǎo)致母血中cff DNA增多；另一方面，在高血壓等病理情況下，母體的肝、腎對(duì)cff DNA的清除減少［27］，致使cff DNA 的濃度升高。Cotter等［28］對(duì)88個(gè)病例和176個(gè)正常對(duì)照研究，發(fā)現(xiàn)早期母血中游離胎兒DNA增加的孕婦將更易發(fā)展為先兆子癇，游離胎兒DNA的量和先兆子癇的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之間存在一種劑量關(guān)系。另由Levine等［29］研究的較大樣本量的結(jié)果顯示，在120例發(fā)展為先兆子癇的病人和120例正常人群對(duì)照中，在相同孕周條件下，前者的cff DNA量為后者的2～5倍。InIllanes S等［30］在患有妊娠期高血壓病的孕婦外周血中檢測(cè)到cff DNA顯著升高，而在子癇發(fā)作之前其水平則有異常升高的情況。因此測(cè)定cff DNA的濃度可能對(duì)先兆子癇的篩查具有一定意義。但也有研究結(jié)果認(rèn)為中孕期cffDNA的濃度不能預(yù)測(cè)不良妊娠結(jié)局［31］。該研究收納了611名孕婦，對(duì)其檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，有不良妊娠結(jié)局的病例不能與cff DNA的濃度建立對(duì)應(yīng)關(guān)系。由于對(duì)cff DNA的濃度預(yù)測(cè)價(jià)值存在爭論，所以只有經(jīng)過大樣本多中心的研究，才能對(duì)cff DNA濃度的真正預(yù)測(cè)價(jià)值進(jìn)行有效評(píng)估。

3.4 胎兒非整倍體染色體病 通常由于異常的減數(shù)分裂，使細(xì)胞內(nèi)同源染色體數(shù)目發(fā)生改變，產(chǎn)生非整倍體胎兒。部分非整倍體胎兒會(huì)發(fā)生自然流產(chǎn)，而有一部分則可存活出生，但幾乎都存在出生缺陷，最常見的是21三體綜合征。早期研究發(fā)現(xiàn)孕有21三體綜合征胎兒的孕婦血漿中胎兒游離DNA量比正常組高。近年來，由于胎兒標(biāo)記物和檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展和相互結(jié)合應(yīng)用，胎兒非整倍體染色體病的診斷不斷進(jìn)步。2010年，Tong等［32］應(yīng)用母胎差異性甲基化及dPCR技術(shù)相結(jié)合的新方法檢測(cè)21-三體，成功檢測(cè)5例21-三體產(chǎn)婦的血漿樣本，另外24個(gè)整倍體的孕婦血漿的分析，出現(xiàn)一個(gè)假陽性，可見表觀遺傳的染色體劑量方法也是非侵入性產(chǎn)前診斷的一種新方法。而在大規(guī)模并行基因組測(cè)序技術(shù)的推動(dòng)下，母血漿cff DNA應(yīng)用于常見非整倍體的診斷研究，取得了更大發(fā)展。Fan等［33］首次對(duì)18例樣本進(jìn)行高通量測(cè)序分析，準(zhǔn)確檢測(cè)出9例21三體、2例18三體、1例13三體和6例染色體整倍體。Bianchi等［34］通過對(duì)532例唐氏高危樣本進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)其唐氏綜合征的靈敏度為100%，假陽性率為0，性別檢測(cè)的靈敏度大于99%。而Jiang等［35］對(duì)903名孕婦的研究顯示，在該研究組中16例21三體胎兒、12例18三體胎兒、2例13三體胎兒全部檢測(cè)診斷正確，但存在1例18三體的假陽性，其對(duì)常染色體三體的檢測(cè)敏感性為100%，特異性為99.9%；在7例性染色體異常的病例中發(fā)現(xiàn)1例假陰性存在，其對(duì)性染色體三體的檢測(cè)敏感性為85.7%，特異性為99.9%。由于雙胎及多胎的母血中的濃度及胎兒遺傳物質(zhì)的區(qū)分等困難，使雙（多）胎的研究較少。有研究［36］檢測(cè)4例雙胎樣本，其中1例為47，XY，＋21核型的同卵雙胎；另1例為異卵雙胎，2個(gè)胎兒之一為1三體，另一胎兒核型正常；剩余2例雙胎核型正常。Canick等［37］對(duì)25例雙胎進(jìn)行檢測(cè)，其中17例整倍體，5例同卵T21、2例異卵T21、1例異卵T13均得到準(zhǔn)確檢測(cè)；另外2例三胎正常病例也的到準(zhǔn)確預(yù)測(cè)。雖然目前在雙（多）胎病例研究中有較好的檢出率和極低的假陽性率，但由于雙（多）胎病例的復(fù)雜性，仍需要有更多的病例進(jìn)行驗(yàn)證。

該技術(shù)對(duì)單胎的常見常染色體數(shù)目異常疾病診斷的技術(shù)較成熟，但對(duì)雙胎及其他染色體異常包括數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常都需要大量的樣本的研究和技術(shù)的提高。在大規(guī)模推廣應(yīng)用之前需要有更多的檢測(cè)支持及經(jīng)濟(jì)性、實(shí)用性、合理性的分析，以減少不恰當(dāng)應(yīng)用帶來的不必要損失［38］。

3.5 胎兒染色體片段異常 鑒于利用胎兒游離DNA采用基因組測(cè)序的方法診斷21、13、18及性染色體數(shù)目異常的技術(shù)的發(fā)展和延伸，研究者同樣應(yīng)用測(cè)序技術(shù)來診斷胎兒染色體片段異常，并取得較好驗(yàn)證結(jié)果。Peters等［39］對(duì)確診的1例父源性12p11.22～12p12.1缺失的胎兒進(jìn)行無創(chuàng)診斷實(shí)驗(yàn)，在其母妊娠35周時(shí)提取母血漿游離DNA，用7例染色體正常的標(biāo)本進(jìn)行對(duì)照，并對(duì)12號(hào)和14號(hào)染色體進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)和數(shù)據(jù)分析。結(jié)果顯示，病例胎兒在12號(hào)染色體上存在約4Mb長度的微缺失，與對(duì)照組的結(jié)果比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Taylor等［40］近期又對(duì)2例中孕期22q11.2微缺失的胎兒進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)，同樣成功檢測(cè)到2例胎兒的微缺失存在，對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。雖然在胎兒染色體片段異常的診斷方面有一定的進(jìn)展，但仍然存在技術(shù)的局限性，例如增加的數(shù)據(jù)處理需要、全基因組測(cè)序覆蓋的范圍等。另外，臨床的大規(guī)模應(yīng)用還需更多的樣本和臨床驗(yàn)證。

3.6 胎兒單基因疾病 目前單基因病在新生兒中的發(fā)病率達(dá)3‰左右，介入性產(chǎn)前診斷仍是診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，目前可以用cff DNA成功檢測(cè)的單基因病有軟骨發(fā)育不全、囊性纖維化病、地中海貧血、亨廷頓病、強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良、先天性腎上腺增生等。由于缺乏有效區(qū)分母體血漿中高母源性DNA和低胎源性游離DNA的手段，以及母源性基因突變或父母為相同基因突變時(shí)無法診斷胎兒基因型等。目前利用cff DNA檢測(cè)遺傳病只能檢測(cè)父源性單基因遺傳病，且許多遺傳病為突變所致，母胎DNA序列差異很小，所以兩者的鑒別要求實(shí)驗(yàn)有較高的特異性敏感性，而要達(dá)到精確的鑒別在技術(shù)上比較困難，需要更精密的分析儀器和有效的試驗(yàn)方法相結(jié)合。Ding等［15］選擇12例胎兒可能遺傳β-地中海貧血的孕婦胎兒，采用單個(gè)等位基因堿基延伸反應(yīng)對(duì)孕婦血漿中父源性的胎兒等位基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)，成功預(yù)測(cè)到胎兒的基因型。近期，Papasavva等［41］選擇了49個(gè)β球蛋白基因上的高雜合SNP位點(diǎn)，對(duì)101例可能遺傳父源性突變的β-地中海貧血胎兒進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示應(yīng)用此方法對(duì)診斷該疾病有較好的敏感性和特異性，為β-地中海貧血的非侵入性產(chǎn)前診斷提供了藍(lán)本。利用大規(guī)模并行基因組測(cè)序技術(shù)，Lo等［42］利用孕婦血漿中DNA進(jìn)行全基因組測(cè)序，獲得了完整的胎兒及孕婦的基因組序列，構(gòu)建了全基因組遺傳圖譜，為直接利用胎兒游離DNA進(jìn)行無創(chuàng)產(chǎn)前基因診斷開辟了新天地。

也有研究對(duì)母源性突變位點(diǎn)進(jìn)行的探索，F(xiàn)iona等［43］對(duì)5例母胎基因型不同的標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，利用數(shù)字化核酸片段長度的方法來篩選母胎DNA，結(jié)合數(shù)字化突變位點(diǎn)進(jìn)行相對(duì)定量技術(shù)，對(duì)PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物定量分析，統(tǒng)計(jì)分析孕婦血漿中野生型和突變性的比例，來預(yù)測(cè)胎兒的基因型。該檢測(cè)中有3例與預(yù)期結(jié)果相符，雖然該檢測(cè)的標(biāo)本例數(shù)較少，準(zhǔn)確性不是很高，但對(duì)母源性突變的檢測(cè)推進(jìn)具有重要意義。Lun FMF等［44］也采用該方法對(duì)母親為雜合突變的血紅蛋白β鏈上的突變進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示利用數(shù)字化相對(duì)突變劑量和數(shù)字化核酸片段長度相結(jié)合的方法可增加胎兒基因型檢測(cè)率，能讓非侵入性產(chǎn)前診斷單基因病走的更遠(yuǎn)。

4 目前利用孕婦血漿中胎兒DNA行產(chǎn)前診斷的一些問題

孕婦血漿中胎兒游離DNA的研究推動(dòng)了非侵入性產(chǎn)前診斷遺傳病和妊娠相關(guān)疾病的預(yù)測(cè)的發(fā)展。但是，我們?cè)趯?duì)胎兒游離DNA認(rèn)識(shí)和應(yīng)用方面還存在一些問題：①缺乏簡單、有效的胎兒標(biāo)記來證明提取的血漿DNA中有胎兒DNA的存在；②胎兒游離DNA的結(jié)構(gòu)、來源及清除機(jī)制還沒有完全搞清楚；③母血循環(huán)中胎兒DNA是否有轉(zhuǎn)錄活性；④母血中胎兒游離DNA的拷貝數(shù)低，及其富集技術(shù)的局限；⑤PCR的假陰性、假陽性問題，大部分染色體病不能有效診斷；⑥雙胎或多胎的復(fù)雜性也是一個(gè)不可忽視的問題；⑦母源性突變的檢測(cè)、雙親攜帶相同突變的胎兒基因分型、單基因疾病的檢測(cè)的局限性，尚無一種理想、可行的cff DNA基因突變檢測(cè)方法。這些問題都將是今后研究的方向。

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