宋偉峰 羅淑媛

中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院，廣東 廣州 510630

納米炭和亞甲藍(lán)作為肝癌淋巴引流示蹤劑的實(shí)驗(yàn)研究

宋偉峰 羅淑媛

中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院，廣東 廣州 510630

目的：探討納米炭注射液和亞甲藍(lán)注射液腫瘤淋巴結(jié)示蹤對(duì)肝癌根治手術(shù)的應(yīng)用價(jià)值。方法：選用兔VX2腫瘤細(xì)胞株，采用開(kāi)腹腹腔種植法制作兔肝癌模型。將20只新西蘭大白兔隨機(jī)分為亞甲藍(lán)組和納米炭組，各10只。兩組均切除兔肝癌，清掃局部淋巴結(jié)，觀察肝臟的周?chē)馨徒Y(jié)轉(zhuǎn)移癌的個(gè)數(shù)、兩種術(shù)中示蹤劑對(duì)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌的示蹤效果。結(jié)果：淋巴結(jié)染色時(shí)間納米炭組 （100.50± 29.92）s，亞甲藍(lán)組（11.20±4.18）s，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。淋巴結(jié)褪色時(shí)間納米炭組（2.22±0.74）h，亞甲藍(lán)組（1.63±0.54）h，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；準(zhǔn)確性亞甲藍(lán)組87.5%（35／40），納米炭組87.2%（34／39），無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：兔肝癌模型行肝癌切除和淋巴結(jié)清掃手術(shù)中應(yīng)用納米炭注射液和亞甲藍(lán)注射液對(duì)肝癌及淋巴引流具有明顯的示蹤作用，降低手術(shù)清掃的復(fù)雜性和危險(xiǎn)性，避免傳統(tǒng)手術(shù)中淋巴結(jié)清掃過(guò)程的盲目性，能有效降低術(shù)后轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的殘留，能更加安全、便利、快速、徹底地清掃淋巴結(jié)。

納米炭注射液；亞甲藍(lán)注射液；淋巴示蹤；淋巴結(jié)清掃；肝癌模型

原發(fā)性肝癌是危害人類(lèi)健康的重大惡性腫瘤之一，在與腫瘤相關(guān)死亡原因中位列第三［1］。肝癌治療除肝移植外，仍以外科手術(shù)切除為首選治療策略，但肝癌手術(shù)治療后復(fù)發(fā)率高，其中重要因素是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移導(dǎo)致肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移［2］。肝癌的示蹤技術(shù)的應(yīng)用將會(huì)提升肝癌患者的綜合治療水平，降低肝癌轉(zhuǎn)移率和復(fù)發(fā)率。本文通過(guò)模擬人體肝癌治療手術(shù)，探討納米炭和亞甲藍(lán)注射液對(duì)兔肝癌淋巴引流示蹤的效果，分析其應(yīng)用于臨床的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 VX2腫瘤細(xì)胞株由中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心提供。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物及模型的建立 取日本健康大白兔22只，雌雄不拘，3～4月齡，體重2.5～3.0kg。實(shí)驗(yàn)前分籠飼養(yǎng)1周。取健康日本大白兔2只，后腿肌肉中注射細(xì)胞計(jì)數(shù)1× 106／m l的VX2細(xì)胞懸液1.0ml，14天后，注射部位形成可觸及直徑約2cm－2.5cm的類(lèi)球型腫塊，即制成了荷瘤兔。切取腫瘤，剪成1mm×1mm×1mm大小瘤塊待用。剩余20只大白兔稱重，隨機(jī)分為兩組，一組為納米炭組，一組為亞甲藍(lán)組。麻醉后，取上腹正中切口進(jìn)腹，將有齒鑷合并起來(lái)斜行穿刺肝左葉較厚處，使成一個(gè)盲道。夾取2枚瘤塊，塞入此盲道最深處，關(guān)腹。術(shù)后21d兔肝左葉內(nèi)形成直徑約0.8－1cm的類(lèi)球型腫塊。

1.2.2 肝癌淋巴結(jié)示蹤法 納米炭組手術(shù)步驟：麻醉后，取原切口進(jìn)腹，用1ml注射器取0.1m l納米炭注射液于肝臟左葉腫瘤周?chē)?～3點(diǎn)緩慢注射，10s內(nèi)注射完畢。

亞甲藍(lán)組手術(shù)步驟：麻醉后，取原切口進(jìn)腹，用1ml注射器取0.1m l亞甲藍(lán)注射液于肝臟左葉腫瘤周?chē)?～3點(diǎn)緩慢注射，10s內(nèi)注射完畢。

兩組均記錄肝臟周?chē)馨徒Y(jié)數(shù)量、位置，淋巴結(jié)明顯褪色時(shí)間。

1.2.3 組織病理學(xué)檢查 觀察肝癌標(biāo)本有無(wú)包膜、包膜是否完整，有無(wú)衛(wèi)星灶、門(mén)靜脈癌栓，腫瘤切緣1mm范圍內(nèi)是否有腫瘤細(xì)胞。淋巴結(jié)標(biāo)本是否有轉(zhuǎn)移。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。經(jīng)計(jì)量資料正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn)后，均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 （±s）表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 染料褪色時(shí)間 實(shí)驗(yàn)時(shí)每隔5min肉眼觀察，記錄染料從第1枚淋巴結(jié)染色到最后1枚完全褪色時(shí)間。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在淋巴結(jié)染色時(shí)間上，納米炭組為（100.50±29.92）秒，亞甲藍(lán)組為（11.20±4.18）秒，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.000）。淋巴結(jié)褪色時(shí)間的對(duì)比，納米炭組為（2.22± 0.74）h，亞甲藍(lán)組為（1.63±0.54）h，納米炭組較亞甲藍(lán)組時(shí)間長(zhǎng)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.058）。其它指標(biāo)的對(duì)比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 淋巴結(jié)染色枚數(shù) 納米炭組共檢出淋巴結(jié)39枚，其中染色淋巴結(jié)17枚，平均檢出個(gè)數(shù)（1.70±0.95）枚，未染色22枚，病理證實(shí)存在淋巴結(jié)癌轉(zhuǎn)移為16枚，無(wú)轉(zhuǎn)移為23枚。染色淋巴結(jié)有癌轉(zhuǎn)移14枚，染色淋巴結(jié)無(wú)癌轉(zhuǎn)移3枚，淋巴結(jié)無(wú)染色有癌轉(zhuǎn)移2枚，淋巴結(jié)無(wú)染色也無(wú)癌轉(zhuǎn)移20枚，準(zhǔn)確性87.2%（34／39）。

2.3 亞甲藍(lán)組與納米炭組的肝癌觀察 觀察肝癌大體標(biāo)本，可見(jiàn)兩組腫瘤切面均為灰白色、魚(yú)肉狀，質(zhì)地硬，周?chē)８谓M織邊界清楚，無(wú)明顯包膜。

2.4 淋巴結(jié)清掃標(biāo)本結(jié)果的觀察 本實(shí)驗(yàn)在兩組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中，兔肝臟周?chē)疃喟l(fā)現(xiàn)6枚淋巴結(jié)，最少為2枚。染色淋巴結(jié)的發(fā)現(xiàn)部位以肝胃韌帶內(nèi)的肝總動(dòng)脈旁、胃左動(dòng)脈旁和肝十二指腸韌帶內(nèi)的淋巴結(jié)多見(jiàn)。

3 討論

在中國(guó)除了肝移植外，對(duì)肝癌采用外科手術(shù)切除是目前首選的治療方法。但肝癌微轉(zhuǎn)移灶難于發(fā)現(xiàn)，局部轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)清除率低［3］。這將會(huì)導(dǎo)致肝癌根治性切除術(shù)后的復(fù)發(fā)。區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況是大多數(shù)實(shí)體腫瘤分期的重要組成部分，也是預(yù)后的重要指標(biāo)。淋巴結(jié)清掃是實(shí)體瘤根治術(shù)中重要的步驟之一，但其在肝癌患者中的作用仍不明確，以往分析影響肝癌預(yù)后因素的研究中極少考慮淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移因素，對(duì)肝癌局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的研究較少［4］，究其原因是當(dāng)前沒(méi)有前瞻性的隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)結(jié)果來(lái)說(shuō)明系統(tǒng)性清掃淋巴結(jié)對(duì)肝癌病人是有益的，所以目前尚未對(duì)切除原發(fā)肝癌的同時(shí)，是否進(jìn)行淋巴結(jié)的清掃未能達(dá)成共識(shí)［5］。

本實(shí)驗(yàn)在肝癌外科手術(shù)開(kāi)始時(shí)，將經(jīng)驗(yàn)性、盲目性的肝癌切除和淋巴結(jié)清掃手術(shù)變?yōu)樵谥币晽l件下病灶被示蹤的 “有的放矢”的切除過(guò)程，力爭(zhēng)達(dá)到降低肝癌手術(shù)的癌灶殘留和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的遺漏，最終達(dá)到降低肝癌的復(fù)發(fā)，延長(zhǎng)患者生存期的目的。

納米炭注射液內(nèi)主要成分為納米炭顆粒［7］，通常以平均粒徑150nm的團(tuán)粒形式存在，可被巨噬細(xì)胞迅速吞噬，毛細(xì)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的疊瓦狀排列結(jié)構(gòu)，細(xì)胞間隙達(dá)100－500 nm，基底膜不完整，加上組織液和淋巴液的壓力差，淋巴液的向心流動(dòng)，使得納米炭粒能迅速進(jìn)入淋巴管，滯留并集聚于相應(yīng)淋巴組織使其出現(xiàn)可視性黑染［8］。將這種特性應(yīng)用到肝癌切除術(shù)中直視下尋找淋巴結(jié)的操作。綜上所述，應(yīng)用納米炭和亞甲藍(lán)術(shù)中示蹤技術(shù)，將復(fù)雜、易發(fā)生醫(yī)源性損傷的肝臟周?chē)馨徒Y(jié)清掃手術(shù)，變?yōu)榭梢曅?、安全、穩(wěn)妥、有效的操作過(guò)程，兩種染料各具缺優(yōu)點(diǎn)，染色時(shí)間上存在差異，而褪色時(shí)間相當(dāng)，兩種染料在肝癌的淋巴結(jié)顯像效果相當(dāng)。

［1］王英，李文濤.肝癌干細(xì)胞與肝癌的研究進(jìn)展 ［J］.中國(guó)癌癥雜志，2011，21（9）：735－738.

［2］欽倫秀，葉青海，湯釗猷.肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的分子機(jī)制與預(yù)測(cè)：從組學(xué)研究到臨床應(yīng)用.第十三屆中國(guó)科協(xié)年會(huì)第18分會(huì)場(chǎng)——癌癥流行趨勢(shì)和防控策略研究研討會(huì)，2011：67－70.

［3］舒宏，康曉楠，劉銀坤.肝癌轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)分子標(biāo)志物 ［J］.世界華人消化雜志，2010，18（13）：1350－1355.

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1007－8517（2013）13－0074－02

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