吳吉安，曾念開，CHOONG Yew keong，陳向東

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)與微生物研究所，浙江 杭州 310021;2.海南醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，海南 ?？?571199;3.Phytochemistry Unit Herbal Medicine Research Centre Institute for Medical Research，Kuala Lumpur Malaysia 50588;4.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院＆ 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193)

虎乳靈芝 (Lignosus rhinocerus)也稱虎奶，馬來語為cendawan susu rimau (harimau)，英語tiger’s milk mushroom，是一種被馬來西亞原住民廣泛使用的食藥用真菌，被稱為馬來西亞的國寶，大約有400年的應(yīng)用歷史，民間傳說為母虎乳汁滴于地上而生［1-3］。菌核是其藥用部位，有止咳定喘、健脾化濕的功效，民間常用于治療哮喘及咳喘，療效極佳。中醫(yī)認(rèn)為它是一種治療肝炎、肝熱、肝癌、胃病的良藥［4］。近年來虎乳靈芝野生資源因過度采挖而逐漸枯竭。菌類學(xué)家認(rèn)為虎乳靈芝是最有開發(fā)前途的藥用真菌之一［5-6］，人工栽培是解決緊俏出路的有效途徑，但至今未見大規(guī)模商品化生產(chǎn)。為了加快這一名貴食藥用菌的開發(fā)，筆者綜述了近年來虎乳靈芝的研究狀況，以供廣大研究者參考。

1 分類學(xué)地位和生物學(xué)特性

1.1 分類學(xué)地位及分布

虎乳靈芝是一種多孔菌，隸屬于真菌門擔(dān)子菌亞門層菌綱非褶菌目多孔菌科虎乳靈芝屬［7-10］。我國菌物分類學(xué)家稱為孤苓，主要分布于馬來西亞、菲律賓、斯里蘭卡、澳大利亞和東非等，中國分布于海南省保亭黎族自治縣［11-12］。Ryvarden［7］在虎乳靈芝屬下列出5個(gè)種，包括L.dimiticus，L.ekombitii，L.goetzii，L.Rhinocerus 和 L.sacer。最近崔寶凱等［13］在海南尖峰嶺發(fā)現(xiàn)一個(gè)容易和虎乳靈芝混淆的新種L.Hainanensis。相比而言，虎乳靈芝菌管管口較小，有明顯闊橢圓形的擔(dān)孢子。

1.2 形態(tài)特征

子實(shí)體一年生，單生，有柄。肉革質(zhì)，蓋薄，硬，近圓形，7～11 cm，中凹，上表面淡暗褐色到暗褐色，有同心環(huán)紋和放射狀皺紋，有細(xì)絨毛，邊緣不完全或開裂。菌肉白色，約1 mm 厚，菌管白色，長1.5～2.0 mm，孔面白色或淺色，孔口圓形，5～6個(gè)·mm-1，菌柄中生，圓柱形，干時(shí)淺灰白色到灰色，有細(xì)絨毛，長10～14 cm，直徑3.0～3.5 cm。菌肉菌絲二體型，生殖菌絲薄壁，2.5～3.5 μm，有鎖狀聯(lián)合;骨架-結(jié)合菌絲無色，厚壁，樹叢狀，骨架菌絲柄部直徑3～4 μm，分枝末端呈鞭毛狀交織，直徑1～2 μm。擔(dān)孢子近球形或近闊橢圓形，透明，光滑，2.5～3.5 μm×3 μm，生于林中地上，從腐殖層下的菌核長出［12］。

1.3 分子鑒定

Tan 等［14］對(duì)馬來西亞3個(gè)不同產(chǎn)地 (相距100 km 以上)來源的5個(gè)虎乳靈芝種群進(jìn)行了rRNA的ITS 測序和比較，顯示這些分離菌株有高度相同的ITS。以ITS1 區(qū)內(nèi)的DNA 序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)了特定的引物，并且和ITS4 primer 配對(duì)，可作為特有的基于PCR 的遺傳標(biāo)記物鑒定虎乳靈芝。

1.4 生藥鑒定

菌核側(cè)耳在我國俗名為虎奶菇，與虎乳靈芝有著相同的俗稱，2種都是能產(chǎn)生菌核的食藥用菌，所以易被混淆。為此，楊蘭等［15］對(duì)2種菌的菌核從形態(tài)特征、顯微特征、理化性質(zhì)等方面進(jìn)行系統(tǒng)觀察和鑒別，采用紫外-可見光譜 (UV-Vis)法對(duì)2種真菌的乙醇提取物進(jìn)行表征區(qū)分，結(jié)果表明兩者顯微特征有較大差別?；⒛坦降木z多數(shù)粗短，分枝，相互纏繞成團(tuán)塊;而虎乳靈芝的菌絲多數(shù)細(xì)長，不分枝，纏繞及附著于類圓形分泌物上、薄層色譜結(jié)果顯示，虎奶菇至少含有4種或以上的虎乳靈芝至少含有2種或以上的親脂性的甾體或萜類成分。

1.5 人工培養(yǎng)

1.5.1 固體培養(yǎng)

Lai 等［16］發(fā)現(xiàn)菌絲生長的最優(yōu)條件為30℃，pH 值6～7。在葡萄糖-蛋白胨、酵母蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)基上生長最快。加快菌絲生長的碳源和氮源分別是葡萄糖和硝酸鉀。在2%葡萄糖為碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，最適C/N 比為10∶1。

1.5.2 液體培養(yǎng)

虎乳靈芝［17］菌絲在不同pH 值的葡萄糖+酵母粉液體培養(yǎng)基上都會(huì)生長，最適培養(yǎng)基pH 為6～7，即中性微偏弱酸，菌絲顆粒大，長勢好;pH≤5 或pH≥8 時(shí)，菌絲產(chǎn)量明顯下降。虎乳靈芝菌絲在不同碳源的培養(yǎng)基下均可生長，較適宜碳源為果糖、葡萄糖和甘露糖;最適氮源為酵母粉，L-胱氨酸為氮源時(shí)，菌絲生長受到抑制。

1.5.3 菌核人工栽培

黃年來等［18］仿照一般木腐菌進(jìn)行代料栽培試驗(yàn)。母種培養(yǎng)用馬鈴薯葡萄糖瓊脂 (PDA)，菌絲初白色，后淡黃白色至淡粉紅并帶黃褐色，貼于斜面上生長，接種初期每天生長速度2.0～3.5 mm，后期停止生長，變成較堅(jiān)韌的菌皮。原種生產(chǎn)以750 mL 玻璃菌種瓶為培養(yǎng)容器，木屑麥皮培養(yǎng)基，20～25℃培養(yǎng)30～40 d，菌絲長滿全瓶。栽培袋配方為木屑80%，麥皮18%，蔗糖1%，碳酸鈣1%或木屑39%，棉籽殼39%，麥皮20%，蔗糖1%，碳酸鈣1%，在17 cm×35～38 cm×0.05 mm的聚丙烯塑料袋中，20～26℃下1個(gè)半月后菌絲長滿全袋，半年后可采收。

2 生物化學(xué)與營養(yǎng)

Beng 等［19］分析了靜止培養(yǎng) (SC)和攪拌反應(yīng)釜 (STR)2種條件下生長的虎乳靈芝的低分子量蛋白 (LMMP)。STR 條件下虎乳靈芝可獲得相對(duì)較多的蛋白峰。通過表達(dá)差異圖譜分析，總共獲得18個(gè)蛋白簇，分子量基本上都在3～9 ku 范圍內(nèi)。共同蛋白有5.8，6.9 和9.1 ku 3個(gè)，而特有蛋白，SC 有4個(gè)，STR 有9個(gè)。蛋白進(jìn)一步純化后可以分離到更多的峰，STR 的大部分蛋白分子量在3～8 ku 范圍內(nèi)，而SC 一些蛋白分子量達(dá)到了14.3 ku附近。

Wong 等［20］分析比較了虎奶菇、茯苓、虎乳靈芝菌核的非水溶性膳食纖維 (IDF)和水溶性膳食纖維 (DF)的生化和微觀結(jié)構(gòu)性質(zhì)。虎乳靈芝菌核的蛋白含量為 2.75%，灰分 1.52%，脂質(zhì)0.02%，糖95.7%;IDF 中膳食纖維豐富物質(zhì)87.1%，殘余蛋白1.65%，灰分1.02%;DF 中膳食纖維豐富物質(zhì)2.51%，殘余蛋白1.04%，灰分0.02%;IDF 的糖含量分別是葡萄糖89.6%，氨基葡萄糖1.98%，糖醛酸0.57%，氨基、中性和酸性糖總和92.2%;DF 的糖含量分別是葡萄糖18.6%，甘露糖9.57%，半乳糖0.92%，糖醛酸1.12%，氨基、中性和酸性糖總和29.6%。和虎奶菇、茯苓菌核一樣，虎乳靈芝菌核也是典型的糖豐富菌核，粗脂肪含量低?；⑷殪`芝菌核擁有大量的IDF，而且非淀粉多糖 (NSP)尤其高，其中葡萄糖是占優(yōu)勢的糖殘基。相反，SDF 的得率和NSP非常低。掃描電鏡圖顯示IDF 部分的交織菌絲和不溶性物質(zhì)，但是只觀察到SDF 部分的可溶性物質(zhì)的非定型物質(zhì)。相比于SDF 部分，IDF 的顯著的高得率和高純度表明，虎乳靈芝菌核具有作為像麥麩那樣普通IDF 的巨大潛力。

Wong 等［21］利用工業(yè)食品級(jí)的糖降解酶和蛋白水解酶發(fā)展了一種用虎奶菇、虎乳靈芝、茯苓菌核制備DF 的方法。為了評(píng)價(jià)這些菌核DF 在開發(fā)富含纖維產(chǎn)品方面的潛力，他們探索了菌核DF 的理化和功能性質(zhì)，并和當(dāng)前商業(yè)化的DF 進(jìn)行了比較。通過改良的工業(yè)酶等比擴(kuò)大的AOAC 方法，測定了虎乳靈芝菌核DF 各組分的含量，發(fā)現(xiàn)100 g 干物質(zhì)中包含總膳食纖維 (TDF) (92.7 ±2.88)g，殘留蛋白(3.33 ±0.44)g，灰分(1.00 ±0.01)g。100 g 干物質(zhì)包含的單糖葡萄糖 (84.6 ±2.67)g，氨基葡糖 (2.17 ± 0.21) g，甘露糖 (1.11 ±0.13) g，半乳糖 (0.61 ± 0.02) g，鼠李糖(0.53 ±0.03)g，糖醛酸 (0.51 ±0.06)g，可得的單糖總量 (89.5 ±1.25)g?；⑷榫薉F 的pH值5.69 ±0.01，水合能力 (2.72 ± 0.22)%，脂肪結(jié)合能力 (1.87 ±0.02)%，乳化能力 (69.8 ±3.33)%，乳液穩(wěn)定性 (69.5 ±3.08)%。

在模擬人消化道生理?xiàng)l件下，虎乳菌核制成的膳食纖維對(duì)微量元素的結(jié)合能力結(jié)果顯示［22］，除了釋放大部分的內(nèi)源性Ca (97.5% 移除)和Mg(95.7%移除)之外，模擬的胃生理?xiàng)l件也減弱了菌核可能對(duì)外源性微量元素的反向結(jié)合;通過降低陽離子交換能力，移除大量潛在的微量元素螯合劑，包括蛋白質(zhì)和肌醇六磷酸。菌核DF 在模擬小腸生理?xiàng)l件下對(duì)微量元素結(jié)合能力低，特別是Ca和Mg，與其剩余蛋白含量有高度相關(guān)性。在結(jié)腸模擬生理?xiàng)l件下，pH 值為5.8，輕微酸性，接合鈣容易被釋放。

在體外，在嚴(yán)格厭氧條件下，以纖維素為對(duì)照，虎乳靈芝DF 樣品在人糞便勻漿系統(tǒng) (全部體積為50 mL)中干物質(zhì)消失13.5%，接近于虎奶菇(8.56%)，而低于茯苓 (53.4%);有機(jī)物質(zhì)消失14.6%，接近于虎奶菇 (9.82%)，而低于茯苓(57.4%)［23］。3種菌核DF 體外發(fā)酵的差異原因可能是它們不同數(shù)量菌交織 (不同數(shù)量的酶不可接近的細(xì)胞壁組分)以及β-葡聚糖不同的結(jié)構(gòu)排列(分支的連接及程度)所致。

以乳果糖為對(duì)照，從虎乳靈芝菌核中提取的不消化碳水化合物 (NDCs)在體外和Bifidobacterium longum，Lactobacillus brevis，Clostridium celatum 一起培養(yǎng)。24 h 孵育后發(fā)現(xiàn)，相比與C.Celatum，NDCs優(yōu)先刺激了B.Longum 和L.Brevis 的生長［24］。

3 藥理活性

急性毒性評(píng)價(jià)研究顯示，按SD 鼠體重250，500 和1 000 mg·kg-1服用虎乳靈芝菌核粉，連續(xù)飼喂28 d，結(jié)果表明，在生長速率、血液學(xué)和臨床生化參數(shù) (包括腎臟和肝功能參數(shù))方面沒有顯示任何副作用。組織學(xué)結(jié)果顯示，處理不會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物的肝腎心脾肺發(fā)生任何病理變化［25］。

Lai 等［26］從虎乳靈芝菌核中分離了一個(gè)溶于熱水的多糖 (PR-HW)和溶于冷堿的多糖 (PRCA)，分別是多糖蛋白復(fù)合體和葡聚糖，研究了其在體外對(duì)白血病細(xì)胞株抗腫瘤活性。PR-HW 顯示了對(duì)急性早幼粒白血病細(xì)胞HL-60、慢性髓細(xì)胞性白血病細(xì)胞K562、人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞THP-1 的顯著生長抑制;PR-CA 沒顯示抑制性。流式細(xì)胞檢測分析顯示，PR-HW 對(duì)HL-60 的抗增殖效應(yīng)是通過阻止細(xì)胞周期G1 期從而導(dǎo)致了細(xì)胞凋亡。他們還研究了虎乳靈芝菌核多糖對(duì)人免疫細(xì)胞的刺激效應(yīng)［27］。將菌核多糖PR-HW、PR-CA 分別和人體免疫細(xì)胞一起培養(yǎng)，利用RayBio 人細(xì)胞因子抗體分析免疫細(xì)胞釋放到培養(yǎng)基的細(xì)胞外細(xì)胞因子。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞因子IL-2 和I-309 表達(dá)增加(IL-2 和I-309 屬趨化因子亞家族，引起單核細(xì)胞的趨化性)，藉此PRG 顯著地刺激了NK-92MI 細(xì)胞的增殖。菌核多糖刺激了CD56+NK 人正常脾、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的增殖。PR-HW 和PR-CA 處理過的免疫細(xì)胞表面的葡聚糖受體用dectin-1 和同型抗原的抗體進(jìn)行染色，流式細(xì)胞檢測分析顯示，NK-92MI 和 MD 細(xì)胞的 Dectin-1 表達(dá)上調(diào)，但CD56+NK 沒有。

虎乳靈芝菌核的冷水提取物L(fēng)R-CW 對(duì)人乳腺癌細(xì)胞系MCF7 和人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549 有抗增殖作用，IC50 分別是96.7 和466.7 μg·mL-1。相比較而言，LR-CW 對(duì)相應(yīng)的人正常細(xì)胞184 B5 (人胸腺細(xì)胞)和NL 20 (人肺細(xì)胞)沒有顯著的細(xì)胞毒作用。DNA 斷裂研究表明，LR-CW 通過介導(dǎo)細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)對(duì)癌細(xì)胞的作用。對(duì)LR-CW 進(jìn)行Sephadex G-50 凝膠過濾分離可得到高分子量和低分子量部分。高分子量部分主要由糖類 (68.7%)和少量的蛋白質(zhì) (3.6%)組成，低分子量部分則含31%糖類，不含蛋白質(zhì)。只有高分子量部分對(duì)癌細(xì)胞顯示拮抗作用，IC50 分別是70.0 和76.7 μg·mL-1。因此LR-CW 的細(xì)胞毒作用是由于高分子量部分，可能是蛋白質(zhì)或蛋白-糖復(fù)合物［28］。

小鼠巨噬細(xì)胞包括RAW 264.7 細(xì)胞系和原發(fā)性巨噬細(xì)胞，用虎乳靈芝菌核熱水提取物 (PRW)處理后，功能活性得到增強(qiáng)［29］:胞飲作用顯著上調(diào)，活性氧和一氧化氮量增加，TNF-α 和iNOS 的增加。通過流式細(xì)胞儀確定，酵母來源β-葡聚糖細(xì)胞表面受體 (包括Dectin-1，CR3 和TLR2)，發(fā)現(xiàn)在PMs 對(duì)PRW 的反應(yīng)中，細(xì)胞表面Dectin-1+細(xì)胞表達(dá)增加。PRW 提高了IKBα 的磷酸化，從而引發(fā)NF-κB 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，激活了RAW 264.7 細(xì)胞系的巨噬細(xì)胞。因此PRW 的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)可以通過NF-κB 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，介導(dǎo)巨噬細(xì)胞活性。

Eik 等［30］首次報(bào)道了虎乳靈芝的刺激神經(jīng)突起活性，探討了菌核水提物對(duì)PC-12Adh 細(xì)胞株的細(xì)胞突起生長活性。結(jié)果顯示，當(dāng)菌核水提物濃度在20 μg·mL-1(m/V)時(shí)，誘導(dǎo)24.4%細(xì)胞突起生長;另外若在30 μg·mL-1(m/V)神經(jīng)生長因子存在下，可誘導(dǎo)42.1% 細(xì)胞突起生長。神經(jīng)生長因子和菌核提取物在增強(qiáng)細(xì)胞突起生長方面有疊加效應(yīng)。通過用神經(jīng)細(xì)絲蛋白的間接免疫熒光法顯示神經(jīng)細(xì)胞的分化，結(jié)果顯示，水提取物含有神經(jīng)活性復(fù)合物，能在體外刺激細(xì)胞突起生長。

4 展望

作為一種名貴藥用真菌，特別是西醫(yī)出身的馬來西亞前首相馬哈蒂爾在2002年馬來西亞國際生物技術(shù)大會(huì)上提到虎乳靈芝治愈他久咳之病后更是名聲大振［31］。中國從事菌類的科研工作者可以和馬來西亞相關(guān)科研人員一起加強(qiáng)這一具有較高藥用價(jià)值的中藥的研究，以推進(jìn)虎乳靈芝應(yīng)用和開發(fā)。虎乳靈芝價(jià)格昂貴，目前該菌民間使用還只停留在利用野生資源階段，而野生資源正因無節(jié)制采集而日趨減少，應(yīng)加強(qiáng)虎乳靈芝人工培養(yǎng)技術(shù)的研究，人工栽培有良好的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益，發(fā)展前景廣泛。

需要加強(qiáng)野生菌種的收集、優(yōu)異菌株的篩選和馴化工作。優(yōu)良菌株既是高效栽培的關(guān)鍵因素，也是提取生物活性物質(zhì)的基礎(chǔ)。目前人工栽培虎乳靈芝基本上停留在實(shí)驗(yàn)室階段，未實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，產(chǎn)品遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足廣大人民群眾的需要。因此需要進(jìn)一步了解其栽培特性，調(diào)整栽培條件以提高其生物學(xué)效率和縮短生長周期。液體發(fā)酵技術(shù)可以用于工業(yè)化連續(xù)生產(chǎn)，規(guī)模大、產(chǎn)量高、發(fā)酵周期短、生產(chǎn)效率高，因此可以加強(qiáng)虎乳靈芝液體發(fā)酵技術(shù)的研究，為大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

應(yīng)加強(qiáng)虎乳靈芝化學(xué)成分、藥理方面的研究。目前尚缺乏對(duì)虎乳靈芝化學(xué)成分的系統(tǒng)研究，而且虎乳靈芝的有效成分、特有成分等還有待于明確，對(duì)于虎乳靈芝多糖的研究也可繼續(xù)深入?；⒛坦狡渚撕妥訉?shí)體都可用于為食藥用，而一般認(rèn)為虎乳靈芝的子實(shí)體沒有藥用價(jià)值，因此需加強(qiáng)該方面的研究，例如明確子實(shí)體和菌核成分的區(qū)別，虎乳靈芝的最佳采收期等等，以獲得最大的食藥用價(jià)值。

尤其值得指出的是，菌核作為膳食纖維有多個(gè)技術(shù)上的優(yōu)勢，如天然來源，高的膳食纖維含量和好的物理化學(xué)功能特性等，可作為多用途的低熱量食物的配料［32］。以菌核為有效部位的食藥用菌種類較少，可以充分利用這一特色加強(qiáng)產(chǎn)品開發(fā)，滿足保健市場需求。

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