王 照，王鐵峰，王鐵成，魏玉榮，黃 耕，5，趙永坤，5，王承宇，5，楊松濤，5，李忠義，5，高玉偉，5，夏咸柱，5

（1．吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春130118；2．軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，吉林 長(zhǎng)春130122；3．吉林省地方病第一防治研究所，吉林 白城137000；4．白城師范學(xué)院 生物系，吉林 白城137000；5．吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春130122）

干擾素（Interferon，IFN）具有抗病毒、抗細(xì)胞增殖、免疫調(diào)節(jié)等極具醫(yī)療價(jià)值的功能，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于肝炎、多發(fā)性硬化癥、結(jié)核病、布魯菌病等病毒或細(xì)菌病。然而由于IFN在動(dòng)物體內(nèi)半衰期僅2～3h，不能完全發(fā)揮功效，所以基于研究開發(fā)長(zhǎng)效IFN的臨床需要，研究者們應(yīng)用多種思維和方法展開工作，主要分為化學(xué)修飾法、物理修飾法和生物學(xué)修飾法。目前，這些方法都取得了一定的進(jìn)展。本文綜述了長(zhǎng)效IFN的研究現(xiàn)狀，并做出展望，以期對(duì)長(zhǎng)效IFN的深入研究提供幫助。

1 化學(xué)修飾法

化學(xué)修飾法可以延長(zhǎng)IFN半衰期、提高其生物學(xué)活性。目前主要采用聚乙二醇（PEG）化學(xué)修飾法，及在此基礎(chǔ)上進(jìn)行的改造。PEG是環(huán)氧乙烷聚合物，經(jīng)FDA批準(zhǔn)可用于藥品、食品、化妝品的生產(chǎn)。PEG通過(guò)共價(jià)修飾，增加蛋白質(zhì)顆粒直徑，并對(duì)一些不利于蛋白功能長(zhǎng)效發(fā)揮的表面基團(tuán)進(jìn)行覆蓋，在降低藥代動(dòng)力學(xué)的同時(shí)提高了藥效動(dòng)力學(xué)。目前，已經(jīng)有多種PEG修飾的生物藥品獲批準(zhǔn)上市，尤其是在肝炎、結(jié)核病的防治工作中，常有將PEG－IFN與其他輔助性藥物共同應(yīng)用的報(bào)道。

研究者發(fā)現(xiàn)，不同分子量大小的PEG在修飾IFN 時(shí)會(huì)得到不同的效果，Bansal［1］和 Basu［2］的試驗(yàn)都證明了大分子量PEG修飾要優(yōu)于小分子量PEG修飾；Chang［3］用一種叫dock－and－lock的新方法將PEG定點(diǎn)結(jié)合于IFN二聚體的兩個(gè)特殊蛋白酶結(jié)合位點(diǎn)，形成穩(wěn)定的三聚體，延長(zhǎng)了半衰期。dock－and－lock方法是PEG修飾法的一種改進(jìn)，近兩年在其他醫(yī)藥蛋白研究中也有所應(yīng)用，可能取代單純的PEG修飾IFN，成為一種新的生物醫(yī)藥化學(xué)修飾法。

雖然PEG修飾法原理簡(jiǎn)單，效果理想，但是成本較高，尤其在動(dòng)物臨床應(yīng)用中，考慮到經(jīng)濟(jì)效益，更是不利于大量推廣使用，所以該方法目前還主要應(yīng)用于人醫(yī)臨床。

2 物理修飾法

物理修飾法主要是將IFN蛋白嵌于各種微囊、晶體框架等結(jié)構(gòu)內(nèi)，防止IFN被快速消化降解，達(dá)到長(zhǎng)期穩(wěn)定發(fā)揮藥效的目的。這種方法除注射途徑給藥以外，還可應(yīng)用于口服、外用IFN制劑的研發(fā)。目前，不斷嘗試新材料、新形式的物理修飾方法已成為IFN研究方向之一。

Li［4］將牦牛的IFN用固體脂質(zhì)納米粒包裹，體外抗病毒藥效持續(xù)長(zhǎng)達(dá)16d，這種緩釋技術(shù)可用于其他動(dòng)物生物醫(yī)藥的研發(fā)；Foldvari［5］研發(fā)了一種雙相囊泡毫微顆粒，利用該顆粒的三維立體結(jié)構(gòu)可以穿透皮膚角質(zhì)層的細(xì)胞間隙，直接將藥物蛋白送入循環(huán)系統(tǒng)，該技術(shù)可能給IFN等醫(yī)用蛋白藥物的應(yīng)用提供新途徑；Jiang［6－7］利用懸滴擴(kuò)散法，輔以金屬離子制備IFN蛋白晶質(zhì)體，藥效持續(xù)超48h，IFN蛋白的生物活性利用率提高了近1．7倍，該方法不需要各種微囊等外源物質(zhì)，其他功能性蛋白也可以用該方法進(jìn)行修飾。

物理修飾法中還有研究者進(jìn)行了靶向性試驗(yàn)，Giri［8］用經(jīng)過(guò)乳化的多孔層玻璃珠毫微顆粒裝載IFN，同時(shí)在顆粒上吸附了有靶向作用的陽(yáng)離子聚合物，使其靶向性和療效增加了3倍；Jansen［9］將IFN置于唇腭裂手術(shù)的人工膠原支架里，緩釋IFN的同時(shí)，還提高了藥效發(fā)揮效率及靶向性，為需要植入附加器材的臨床治療提供了一個(gè)新思路?？梢?jiàn)運(yùn)用物理方法修飾IFN的研究中增加其靶向性將會(huì)成為新的研究熱點(diǎn)，但也要注意到新藥品的使用成本可能會(huì)偏高。

由近年的報(bào)道來(lái)看，長(zhǎng)效IFN的物理修飾研究正向著具備多重優(yōu)點(diǎn)的IFN醫(yī)用制劑方面發(fā)展。這需要醫(yī)學(xué)和其他領(lǐng)域研究人員的共同努力，加大跨領(lǐng)域的合作研究，相信一定會(huì)取得更好的成果。

3 生物學(xué)修飾方法

生物學(xué)修飾法因其易于優(yōu)化改進(jìn)，成本和操作方面優(yōu)于化學(xué)和物理修飾法，所以目前它是長(zhǎng)效IFN研究最為深入的方法。生物學(xué)修飾法主要有融合蛋白、基因重組、糖基化3種形式。

3．1 融合蛋白 IFN融合蛋白的研發(fā)，最初是基于融合蛋白顆粒的空間位阻大，可以降低消化酶的降解作用，減慢機(jī)體的排泄濾除速度，從而延長(zhǎng)IFN體內(nèi)半衰期，而目前IFN融合蛋白也開始同時(shí)注重靶向性、功能多樣性的研究。

血清白蛋白（Serum Albumin，SA）融合蛋白技術(shù)近年來(lái)又取得了新的進(jìn)展。Nelson［10］證明了融合蛋白HSA－IFN在成本低于PEG－IFN的前提下，完全可以取代現(xiàn)有的PEG－IFN。Miyakawa［11］制備鼠IFN－MSA融合蛋白，使鼠IFN效果至少提高3倍。這是繼人血清蛋白與IFN融合后，首次對(duì)動(dòng)物血清白蛋白與動(dòng)物IFN進(jìn)行融合研究，表明這種人醫(yī)中成功的長(zhǎng)效IFN融合蛋白方案也可應(yīng)用于動(dòng)物長(zhǎng)效IFN的醫(yī)藥開發(fā)，為人畜共患病的防治工作帶來(lái)新的有利工具。還有研究者用PEG對(duì)融合蛋白再修飾，半衰期較融合蛋白延長(zhǎng)了12～15倍［12］，這個(gè)試驗(yàn)首次將多種技術(shù)結(jié)合共同開發(fā)長(zhǎng)效IFN，為進(jìn)一步研發(fā)新型長(zhǎng)效IFN開辟了新的思路。

除了血清白蛋白，還有研究將IFN與其他功能性蛋白相融合，制備長(zhǎng)效多效IFN。如Vallee［13］報(bào)道IFN與免疫球蛋白Fc片段的融合蛋白IFN－Fc；Fioravanti［14］將IFN與載脂蛋白融合，幫助蛋白穿透血腦屏障；Li［15］表達(dá)IFN與抗菌肽CM4融合蛋白，使IFN融合蛋白具有了直接抗細(xì)菌、真菌的作用；Kim［16］將人IFN－α1的 C末端融合聯(lián)入酸性標(biāo)簽α－核突觸蛋白，提高了IFN保存和運(yùn)輸過(guò)程中的穩(wěn)定性；Walker［17］將抗血清白蛋白抗體結(jié)合域與IFN組成融合蛋白，延長(zhǎng)IFN半衰期。同時(shí)，在多效長(zhǎng)效IFN研究工作中，靶向融合蛋白也是目前研究的一個(gè)熱點(diǎn)。Bansal［18］將IFN與具有靶向作用的小肽相連，減少了IFN與非靶向細(xì)胞的結(jié)合，降低了IFN引發(fā)的副作用；同年，Cai［19］制備的半乳糖－人血清白蛋白－IFN 融合蛋白和 Fioravanti［20］制備的IFN－載脂蛋白AⅠ融合蛋白也具有靶向作用。靶向融合蛋白半衰期長(zhǎng)，副作用小，治療效果好，但該方法也可能縮減了IFN的廣譜性。值得注意的是，這種靶向性IFN融合蛋白的研究性文章連續(xù)兩期在 《Hepatology》雜志上發(fā)表［18，20］，可見(jiàn)這種靶向性融合蛋白的研究工作是目前的一個(gè)熱點(diǎn)，有深入研究的價(jià)值。

總體來(lái)說(shuō)，IFN融合蛋白犧牲了部分藥效動(dòng)力學(xué)而提高了藥代動(dòng)力學(xué)，所以如何調(diào)整IFN融合蛋白的藥效動(dòng)力學(xué)與藥代動(dòng)力學(xué)之間的平衡點(diǎn)，最大限度的發(fā)揮融合蛋白的臨床作用，也將會(huì)成為長(zhǎng)效IFN研究的一個(gè)重要目標(biāo)。

3．2 基因重組 通過(guò)基因重組方式直接改造IFN，最大限度的保留了IFN的天然生物學(xué)特性。Huang［21］和 Hou［22］分別對(duì)多組豬、雞IFN－α序列進(jìn)行分析，重新整合出了優(yōu)化的豬、雞重組IFN－α，他們的活性與半衰期都優(yōu)于天然IFN。這種活性的提高可能與受體結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸的改變或IFN結(jié)構(gòu)的微觀變化有關(guān)，在動(dòng)物與人類IFN中都可以應(yīng)用。同時(shí)，在定點(diǎn)突變技術(shù)方面，Yamamoto［23］對(duì)人IFN－α上的3個(gè)受體結(jié)合位點(diǎn)置換突變，改變了其凝集能力和生物學(xué)活性，Zhao［24］將 HSA－IFN－α2b中白蛋白亞基的第34位的半胱氨酸突變成絲氨酸，進(jìn)一步延長(zhǎng)了蛋白體內(nèi)半衰期。

基因重組方法將來(lái)的研究趨勢(shì)是尋找發(fā)現(xiàn)更多的可用于突變重組的氨基酸位點(diǎn)，甚至突破IFN蛋白空間構(gòu)象的限制，制備出更高活性的長(zhǎng)效IFN。

3．3 糖基化 糖基化修飾也可以延長(zhǎng)IFN的半衰期，Ceaglio［25－26］在IFN 的4個(gè)位點(diǎn)引 入 糖 基 化 后，IFN的半衰期延長(zhǎng)了25倍，其生物學(xué)特性也有所提高，甚至優(yōu)于FDA已經(jīng)批準(zhǔn)的佩樂(lè)能。但是，糖基化修飾也存在著增加IFN免疫原性，易引發(fā)中和抗體反應(yīng)的不足，需要進(jìn)一步的研究和探索。

4 展望

近年來(lái)長(zhǎng)效IFN研究方面取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展，尤其是2009年以來(lái)，越來(lái)越多的報(bào)道體現(xiàn)出多種方法相結(jié)合，多種學(xué)科相結(jié)合的理念，表明未來(lái)的長(zhǎng)效IFN的研制將向著多元化、跨學(xué)科的方向發(fā)展。今后，在研究長(zhǎng)效IFN的過(guò)程中，可將思路進(jìn)一步拓寬，在其他各種藥劑、細(xì)胞因子、蛋白及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的保護(hù)技術(shù)和促吸收技術(shù)中尋找可能引以參考并應(yīng)用于長(zhǎng)效IFN開發(fā)的相關(guān)技術(shù)，例如營(yíng)養(yǎng)學(xué)中的惰性蛋白抗消化研究、針對(duì)呼吸系統(tǒng)的霧化吸入給藥法等。另外，IFN在使用中有很大的種間差異性，利用長(zhǎng)效IFN的優(yōu)化改良的理念，可能在種間廣譜IFN研究方面也會(huì)有所突破，為長(zhǎng)效IFN的研究建立新的方向。

［1］ Bansal R，Post E，Proost J H，etal．PEGylation improves pharmacokinetic profile，liver uptake and efficacy of Interferon gamma in liver fibrosis［J］．J Control Release，2011，154（3）：233－240．

［2］ Basu A，Yang K，Wang M，etal．Structure－function engineering of interferon－beta－1bfor improving stability，solubility，potency，immunogenicity，and pharmacokinetic properties by site－selective mono－PEGylation［J］．Bioconjug Chem，2006，17（3）：618－630．

［3］ Chang C H，Rossi E A，Cardillo T M，etal．A new method to produce monoPEGylated dimeric cytokines shown with human interferon－alpha2b［J］．Bioconjug Chem，2009，20（10）：1899－1907．

［4］ Li S，Zhao B，Wang F，etal．Yak interferon－alpha loaded solid lipid nanoparticles for controlled release［J］．Res Vet Sci，2010，88（1）：148－153．

［5］ Foldvari M，Badea L，etal．Topical delivery of interferon alpha by biphasic vesicles：evidence for a novel nanopathway across the stratum corneum［J］．Mol Pharm，2010，7（3）：751－762．

［6］ Jiang Y，Shi K，Wang S，etal．A morphological screening of protein crystals for interferon delivery by metal ion－chelate technology［J］．Drug Dev Ind Pharm，2010，36（12）：1389－1397．

［7］ Jiang Y，Shi K，Xia D，etal．Protein spherulites for sustained release of interferon：preparation，characterization and in vivo evaluation［J］．J Pharm Sci，2011，100（5）：1913－1922．

［8］ Giri N，Tomar P，Karwasara V S，etal．Targeted novel surfacemodified nanoparticles for interferon delivery for the treatment of hepatitis B［J］．Acta Biochim Biophys Sin（Shanghai），2011，43（11）：877－883．

［9］ Jansen R G T H，van Kuppevelt，Daamen W F，etal．Interferon－gamma－loaded collagen scaffolds reduce myofibroblast numbers in rat palatal mucosa［J］．Eur J Orthod，2011，33（1）：1－8．

［10］Nelson D R，Benhamou Y，Chuang W L，etal．Albinterferon Alfa－2bwas not inferior to pegylated interferon－alpha in a randomized trial of patients with chronic hepatitis C virus genotype 2or 3［J］．Gastroenterology，2010，139（4）：1267－1276．

［11］Miyakawa N，Nishikawa M，Takahashi Y，etal．Prolonged circulation half－life of interferon gamma activity by gene delivery of interferon gamma－serum albumin fusion protein in mice［J］．J Pharm Sci，2011，100（6）：2350－2357．

［12］Cai Y，Zhang Z，F(xiàn)an K，etal．Pharmacokinetics，tissue distribution，excretion，and antiviral activity of pegylated recombinant human consensus interferon－alpha variant in monkeys，rats and guinea pigs［J］．Regul Pept，2012，173（1－3）：74－81．

［13］Vallee S，Rakhe S，Reidy T，etal．Pulmonary administration of interferon Beta－1a－fc fusion protein in non－h(huán)uman primates using an immunoglobulin transport pathway［J］．J Interferon Cytokine Res，2012，32（4）：178－184．

［14］Fioravanti J，Medina－Echeverz J，Ardaiz N，etal．The fusion protein of IFN－alpha and apolipoprotein A－I crosses the bloodbrain barrier by a saturable transport mechanism［J］．J Immunol，2012，188（8）：3988－3992．

［15］Li N N，Liu P，Chen S L，etal．Construction and expression of a novel bioactive IFN－alpha2b／CM4fusion protein in Escherichia coli［J］．Microbiol Res，2010，165（2）：116－121．

［16］Kim Y M，Lee H J，Lee J E，etal．Expression of human interferon alpha－1with enhanced stability via the tagging system of a stabilizing peptide［J］．Protein Expr Purif，2009，63（2）：140－146．

［17］Walker A，Dunlevy G，Rycroft D，etal．Anti－serum albumin domain antibodies in the development of highly potent，efficacious and long－acting interferon［J］．Protein Eng Des Sel，2010，23（4）：271－278．

［18］Bansal R，Prakash J，Post E，etal．Novel engineered targeted interferon－gamma blocks hepatic fibrogenesis in mice［J］．Hepatology，2011，54（2）：586－596．

［19］Cai G，Jiang M，Zhou Y，etal．Generation of a liver targeting fusion interferon and its bioactivity analysis in vitro［J］．Pharmazie，2011，66（10）：761－765．

［20］Fioravanti J，Gonzalez L，Medina－Echeverz J，etal．Anchoring interferon alpha to apolipoprotein A－I reduces hematological toxicity while enhancing immunostimulatory properties［J］．Hepatology，2011，53（6）：1864－1873．

［21］Huang L，Cao R B，Wang N，etal．The design and recombinant protein expression of a consensus porcine interferon：Co－PoIFN－alpha［J］．Cytokine，2012，57（1）：37－45．

［22］Hou F，Liu K，Shen T，etal．Antiviral activity of rChIFN－alpha against vesicular stomatitis virus and Newcastle disease virus：a novel recombinant chicken interferon－alpha showed high antiviral activity［J］．Res Vet Sci，2011，91（3）：e73－79．

［23］Yamamoto K，Taniai M，Torigoe K，etal．Creation of interferon－alpha8mutants with amino acid substitutions against interferon－alpha receptor－2binding sites using phage display system and evaluation of their biologic properties［J］．J Interferon Cytokine Res，2009，29（3）：161－170．

［24］Zhao H L，Xue C，Wang Y，etal．Elimination of the free sulfhydryl group in the human serum albumin （HSA）moiety of human interferon－alpha2band HSA fusion protein increases its stability against mechanical and thermal stresses［J］．Eur J Pharm Biopharm，2009，72（2）：405－411．

［25］Ceaglio N，Etcheverrigaray M，Conradt H S，etal．Highly glycosylated human alpha interferon：An insight into a new therapeutic candidate［J］．J Biotechnol，2010，146（1－2）：74－83．

［26］Ceaglio N，Etcheverrigaray M，Kratje R，etal．Novel long－lasting interferon alpha derivatives designed by glycoengineering［J］．Biochimie，2008，90（3）：437－449．