張殿寶，施 萍，龐希寧*

(中國醫(yī)科大學1.基礎醫(yī)學院干細胞與再生醫(yī)學研究室;2.附屬第一醫(yī)院全科醫(yī)學教研室，遼寧沈陽110001)

隨著全基因組測序技術的進步和DNA 元件百科全書計劃(encyclopedia of dna elements，ENCODE)等后基因組計劃的實施［1］，將大量的數(shù)據(jù)轉化為功能和臨床相關的信息成為我們新的挑戰(zhàn)。解決該問題的核心是闡明基因型對表現(xiàn)型的影響［2］。傳統(tǒng)的同源重組技術失活靶基因的效率低下、耗時費力且具有回復突變的風險，RNAi 技術對靶基因失活不完全、重復性差、有脫靶效應［3］，因此亟需優(yōu)秀的基因組編輯工具克服這些缺點。近年來發(fā)展起來的人工核酸酶(engineered nucleases，EN)技術為此帶來了新的曙光，使研究者能夠對不同物種和細胞中的幾乎所有基因進行編輯［4］。本文對EN 的類型、原理、應用及存在的問題等進行綜述。

1 利用EN 進行基因組定點修飾的一般原理

EN 進行基因組定點修飾主要包括2 個步驟［5］:首先，設計并構建EN，進而在靶位切斷基因組DNA，形成雙鏈斷裂(double-strand break，DSB);其次，DNA 損傷激活DNA 修復通路，啟動自我修復。修復通常由一種或兩種途徑完成:切斷的DNA 末端進行易錯的非同源末端連接(non-homologous end joining，NHEJ)，或利用DNA 模板進行同源重組(homologous recombination，HR)。NHEJ 修復能夠產生較小的插入或缺失，使基因發(fā)生突變或完全敲除;而以引入的同源DNA 為模板進行HR 修復，能夠對基因組進行定點修飾。

2 人工核酸酶的類型

目前，EN 主要包括4 類:鋅指核酸酶(zinc-finger nuclease，ZFN)、類轉錄激活因子效應物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease，TALEN)、CRISPR/Cas 系統(tǒng)(clustered regulatory interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated systerm，CRISPR/Cas)和人工的大范圍核酸酶(engineered meganuclease，EM)。

2.1 ZFN

ZFN 由DNA 結合結構域和切割結構域組成。DNA 結合域來自鋅指蛋白(zinc-finger protein，ZFP)，一般包括3 ～6 個Cys2His2 鋅指重復單位，每個ZFP 能夠相對特異地識別靶位上的3 個連續(xù)的堿基，因此每對ZFN 能夠識別18 ～36 個堿基。ZFP 由約30 個氨基酸殘基組成，呈α-β-β 結構，其中α 螺旋中的－1 ～+6 氨基酸殘基決定其特異性，改變這些氨基酸的組成可以設計出識別不同堿基的ZFP。ZFN 的切割結構域與結合結構域的C 端相連，目前多應用來源于海床黃桿菌(Flavobacterium okeanokoites)的Fok Ⅰ核酸酶，F(xiàn)ok Ⅰ能夠二聚化產生核酸內切酶活性［6］。

將ZFN 的質?；騧RNA 通過轉染或注射進入細胞后，核定位信號引導ZFN 進入細胞系，兩個ZFN分子的Fok Ⅰ結合結構域與目標位點結合，如果DNA 雙鏈上的這兩個位點的方向和距離合適，兩個Fok Ⅰ分子在間隔區(qū)形成二聚體，造成DSB，啟動DNA 修復機制［7］。

ZFN 的構建包括靶位選擇、ZFP 構建、Fok Ⅰ切割域的選擇和優(yōu)化等步驟。ZFN 的設計至關重要，除了根據(jù)已知的ZFP 結合位點直接構建ZFN 外，Joung 成立的“鋅指聯(lián)合會”提供在線軟件ZiFiT，其中包括模塊組裝(modular assembly，MA)，OPEN(oligomerized pool engineering)和CoDA(context dependent assembly)方法;另外，還有Sangamo 私有的雙鋅指模塊組裝方法和Wolfe 實驗室的方法等可供選擇使用。

目前，ZFN 已應用于植物、動物和微生物的研究中。與傳統(tǒng)的基因操作技術相比，技術優(yōu)勢明顯，尤其是定點整合的突破。一般情況下，引入細胞的ZFN 為瞬時表達，對細胞毒性較小。但是，ZFN 的設計篩選耗時費力，而且可能存在脫靶效應，使其未能成為廣泛應用的常規(guī)技術［8］。

2.2 TALEN

TALEN 自2010年成功應用于基因打靶，結構與ZFN 類似，其DNA 結合結構域TALE 蛋白家族來自黃單胞桿菌(Xanthomonas spp.)。該結構域由12 ～30 個重復單元串聯(lián)構成，每個重復單元由33 ～35 個氨基酸殘基組成，其中的第12、13 位氨基酸殘基稱為重復可變雙殘基(repeat variable di-residue，RVD)。每個RVD 負責識別1 個DNA 堿基，不同的RVD 能夠特異性識別4 種堿基中的一種或多種［9］。TALE 重復單元與靶序列具有很好的對應性，編碼比ZFN 簡單，對提高特異性和設計人工核酸酶更有利。將設計好的TALE 與Fok Ⅰ核酸酶融合，就形成了能夠識別并切割特定DNA 序列的新核酸酶TALEN。TALEN 蛋白一般在N 端有轉運信號(translocation signal)，C 端有核定位信號和轉錄激活結構域(activation domain，AD)，中部是介導其與DNA 特異識別與結合的結構域。一對TALEN 分子與靶位結合后，F(xiàn)ok Ⅰ在間隔區(qū)二聚化切斷 DNA 雙鏈，形成DSB［10］。

靶位點的選擇和TALEN 的組裝是應用TALEN的關鍵。目前普遍認為，TALEN 靶位點5'端前一位的堿基應為T。為優(yōu)化設計，一些實驗室構建了預測設計TALEN 靶點的服務器可供使用，如TALE-NT(https://tale-nt．cac．cornell．edu)、ZiFiT (http://zifit．partners．org/ZiFiT)和idTALE(http://idtale．kaust．edu．sa)等。

TALE 重復單元的序列幾乎相同，提高了串聯(lián)克隆的難度。TALEN 的構建主要依靠分子克隆的手段，目前已形成了幾種快速有效的方法:基于Golden Gate 分子克隆的方法，根據(jù)單體的來源不同可分為基于PCR 的Golden Gate-PCR 和傳統(tǒng)的基于質粒載體的Golden Gate-Vector;基于連續(xù)克隆組裝的方法:包括限制性酶切-連接法(restriction enzyme and ligation，REAL)、單元組裝法(unit assembly，UA)和id-TALE 一步酶切次序連接法;基于固相合成的高通量方法:包括FLASH 和ICA(iterative capped assembly);基于長黏末端的LIC(ligation-independent cloning)組裝方法等。

目前，TALEN 已在體外及植物、酵母、動物和人細胞中得到應用。TALEN 有潛力成為一種操作方便、特異性強、經濟高效、適用范圍廣的基因組定點修飾技術。

2.3 CRISPR/Cas 系統(tǒng)

CRISPR/Cas 系統(tǒng)是一種基于Ⅱ型原核CRISPR 自適應免疫系統(tǒng)的基因組編輯工具，由RNA 引導Cas9核酸酶對DNA 進行靶向編輯［11］。CRISPR/Cas 系統(tǒng)存在于約40%的細菌和90%的古生菌中，用于抵抗外源的DNA 片段［12］?；撔枣溓蚓鶶treptococcus pyogenes 中的Ⅱ型CRISPR 系統(tǒng)組成比較簡單，易于構建和使用，其中包括Cas9 核酸酶和兩個非編碼RNA:一個成熟的CRISPR RNA(crRNA)和一個部分互補的反式作用RNA(tracrRNA)，這3 個組分能夠有效地沉默外源DNA［13］。目前，研究者已成功構建小引導RNA(sgRNA)優(yōu)化CRISPR/Cas 系統(tǒng)。sgRNA 包含3 個結構域:約20 nt 的互補區(qū)決定其與DNA 結合的特異性;約42 nt 的發(fā)夾結構域模擬tracrRNA-crRNA復合物，能夠與Cas9 結合;此外，還包括一個約40 nt的轉錄終止子。結合特異性由sgRNA-DNA 堿基配對和DNA 互補區(qū)上游的前間隔相鄰基序(protospacer adjacent motifs，PAM)決定［14］。CRISPR 系統(tǒng)只需要Cas9 蛋白和sgRNA 就能夠進行宿主非依賴性的基因打靶，將表達Cas9 和sgRNA 的質粒轉入細胞后，Cas9 蛋白與sgRNA 結合形成蛋白-RNA 復合物，該復合物與DNA 靶位通過堿基配對特異性結合后，靶位DNA 在核酸內切酶Cas9 的作用下形成DSB［15］。

使用CRISPR/Cas 系統(tǒng)對基因組進行定點編輯不需要構建大分子質量的核酸酶，只需要設計引導RNA 就能對幾乎任意序列進行靶向編輯。該系統(tǒng)已成功應用于微生物、動物細胞和轉基因動物，并可以同時作用于多個靶位［16］。CRISPR/Cas 系統(tǒng)與ZFN 和TALEN 相比，具有更好的擴展性，更加經濟實惠、易于構建。

2.4 人工大范圍核酸內切酶

大范圍核酸內切酶廣泛存在于微生物中，能夠識別較長的DNA 序列(＞12 bp)，具有較好的特異性。但是，目前已知的MN 較少，不能覆蓋所有的靶位點，不能夠作為切割特異性位點的工具。為此，研究者試圖人工構建更多的MN 以供使用:使用突變的方法構建識別特異序列的MN［17－18］;有研究者將不同的酶融合在一起形成雜交酶，識別新的序列［19］;另外，“rationally designed meganuclease”方法(US Patent No:8338157、8304222)是改變與DNA 相互作用的氨基酸來設計特異性位點的MN。最近，有研究人員成功應用MN 構建了基因敲除小鼠和大鼠［20］。MN 與靶位的識別比較嚴格，因此其毒性可能小于以上幾種人工核酸酶。由于MN 種類的限制，目前還不能大范圍應用于基因組定點修飾。

3 展望

ZFN、TALEN 和CRISPR/Cas 系統(tǒng)作為基因組定點修飾工具的應用具有革命性意義。長期以來，ZFP是唯一能夠提供與DNA 定點結合的蛋白和酶的技術，但方法本身的復雜性限制了它的應用。直到TALE 與DNA 特異性識別的分子密碼被破解后，研究人員借鑒ZFN 的策略對天然的TALE 進行改造，使其成為基因組定點編輯的工具，由于其技術門檻較低，一出現(xiàn)就得到了廣泛的研究和應用。而最近發(fā)展起來的CRISPR/Cas 系統(tǒng)似乎可以更簡便地進行基因組編輯。雖然這些基因組編輯工具的效率、毒性等還需要進一步評估，但隨著研究的深入，人工核酸酶技術的進步必然推動基礎醫(yī)學和個體化治療的發(fā)展。

［1］Rosenbloom KR，Sloan CA，Malladi VS，et al．ENCODE data in the UCSC genome browser:year 5 update［J］．Nucleic Acids Res，2013，41:56－63．

［2］Gaj T，Gersbach CA，Barbas CF，et al．ZFN，TALEN，and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering［J］．Trends Biotechnol，2013，31:397－405．

［3］Mohr SE，Perrimon N．RNAi screening:new approaches，understandings，and organisms［J］．Wiley Interdiscip Rev RNA，2012，3:145－158．

［4］Pan Y，Xiao L，Li AS，et al．Biological and biomedical applications of engineered nucleases［J］．Mol Biotechnol，2013，55:54－62．

［5］de Souza N．Primer:genome editing with engineered nucleases［J］．Nat Methods，2012，9:27．

［6］Palpant NJ，Dudzinski D．Zinc finger nucleases:looking toward translation［J］．Gene Ther，2013，20:121－127．

［7］Carroll D．Genome engineering with zinc-finger nucleases［J］．Genetics，2011，188:773－782．

［8］Bhakta MS，Henry IM，Ousterout DG，et al．Highly active zinc-finger nucleases by extended modular assembly［J］．Genome Res，2013，23:530－538．

［9］Joung JK，Sander JD．TALENs:a widely applicable technology for targeted genome editing［J］．Nat Rev Mol Cell Biol，2013，14:49－55．

［10］Mussolino C，Morbitzer R，Lutge F，et al．A novel TALE nuclease scaffold enables high genome editing activity in combination with low toxicity［J］．Nucleic Acids Res，2011，39:9283－9293．

［11］Wiedenheft B，Sternberg SH，Doudna JA．RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea［J］．Nature，2012，482:331－338．

［12］Makarova KS，Haft DH，Barrangou R，et al．Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems［J］．Nat Rev Microbiol，2011，9:467－477．

［13］Gasiunas G，Barrangou R，Horvath P，et al．Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria［J］．Proc Natl Acad Sci U S A，2012，109:2579－2586．

［14］Jinek M，Chylinski K，F(xiàn)onfara I，et al．A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity［J］．Science，2012，337:816－821．

［15］Cong L，Ran FA，Cox D，et al．Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems［J］．Science，2013，339:819－823．

［16］Wang H，Yang H，Shivalila CS，et al．One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering［J］．Cell，2013，153:910－918．

［17］Seligman LM，Chisholm KM，Chevalier BS，et al．Mutations altering the cleavage specificity of a homing endonuclease［J］．Nucleic Acids Res，2002，30:3870－3879．

［18］Rosen LE，Morrison HA，Masri S，et al．Homing endonuclease I-CreI derivatives with novel DNA target specificities［J］．Nucleic Acids Res，2006，34:4791－4800．

［19］Smith J，Grizot S，Arnould S，et al．A combinatorial approach to create artificial homing endonucleases cleaving chosen sequences［J］．Nucleic Acids Res， 2006，34:149．

［20］Menoret S，F(xiàn)ontaniere S，Jantz D，et al．Generation of Rag1-knockout immunodeficient rats and mice using engineered meganucleases［J］．FASEB J，2013，27:703－711．