■ 郭曉明 高安翔 陸圣杰 許甲平馮一凡 吳亞斌

（1.上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，上海 201418;2.上海德邦牧業(yè)有限公司，上海 201108）

甘氨酸亞鐵具有穩(wěn)定性好、吸收率高、無(wú)胃腸刺激及生物學(xué)效價(jià)高的特點(diǎn)，是新一代的補(bǔ)鐵添加劑[1]。在飼料中添加甘氨酸亞鐵為防治動(dòng)物貧血癥和增強(qiáng)動(dòng)物免疫力提供了一條高效、安全、簡(jiǎn)便的途徑。

甘氨酸亞鐵產(chǎn)品中游離甘氨酸（未螯合的甘氨酸）的含量反映生產(chǎn)過(guò)程中甘氨酸與亞鐵離子的螯合率，在一定的前提條件下也能反映甘氨酸亞鐵的穩(wěn)定性，是評(píng)價(jià)生產(chǎn)工藝和產(chǎn)品性能的一項(xiàng)重要指標(biāo)，當(dāng)前主要采用非水滴定法測(cè)定[2]。

本文采用分光光度法來(lái)測(cè)定甘氨酸亞鐵產(chǎn)品中游離甘氨酸的含量?？疾炝孙@色劑濃度、還原劑濃度、顯色反應(yīng)時(shí)間及溫度等參數(shù)對(duì)吸光度的影響，確定了最佳顯色條件，繪制了工作曲線并應(yīng)用于實(shí)際樣品的測(cè)試，獲得了較好的測(cè)定結(jié)果。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及試劑

雙光束紫外可見分光光度計(jì)（TU-1901，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）、循環(huán)水式真空泵（河南鞏義予華儀器廠）、恒溫水浴槽（HHS-21，上海博迅醫(yī)療設(shè)備有限公司）、電子天平（BS224S，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）、微量移液器（大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。

甘氨酸、茚三酮、抗壞血酸、乙醇、乙二醇甲醚、冰醋酸、無(wú)水醋酸鈉均為分析純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司），甘氨酸亞鐵由作者實(shí)驗(yàn)室自行制備。茚三酮用乙二醇甲醚溶解，配制成3%(wt.%)的溶液，抗壞血酸用去離子水溶解，配制成0.3%(wt.%)的溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 顯色反應(yīng)條件的確定

稱取30 mg甘氨酸，加入到50 ml冰醋酸中，攪拌溶解，轉(zhuǎn)移到100 ml的容量瓶中，用1 mol/l的醋酸鈉定容。從中移取10 ml再用1 mol/l醋酸鈉溶液定容至100 ml。移取5.0 ml該溶液到25 ml的容量瓶中，加入抗壞血酸和茚三酮，將容量瓶置于一定溫度下的水浴槽中，水浴反應(yīng)一定時(shí)間。取出，迅速冷卻至室溫，用50%乙醇溶液定容至25 ml。用分光光度計(jì)在570 nm處測(cè)量溶液的吸光度，以試劑空白為參比。改變水浴溫度、水浴時(shí)間、茚三酮和抗壞血酸濃度，考察這些參數(shù)對(duì)吸光度的影響，選擇最佳的顯色反應(yīng)條件。

1.2.2 工作曲線繪制

取30 mg甘氨酸溶解于冰醋酸中，并用冰醋酸定容至50 ml。取該溶液15 ml，用冰醋酸稀釋到50 ml，用1 mol/l醋酸鈉定容到100 ml。移取0.2～1.0 ml該溶液加入到25 ml的容量瓶中，在已確定的最佳顯色條件下顯色并測(cè)定其吸光度，繪制工作曲線。

1.2.3 甘氨酸亞鐵產(chǎn)品中游離甘氨酸的測(cè)定

稱取2.5 g甘氨酸亞鐵樣品加入至30 ml冰醋酸中，攪拌10 min，再浸漬10 min，減壓過(guò)濾，用20 ml冰醋酸分多次洗滌濾瓶。將濾液轉(zhuǎn)移到100 ml的容量瓶中，用1 mol/l的醋酸鈉定容。取1 ml該溶液加入到25 ml的容量瓶中在最佳顯色條件下顯色，測(cè)定其吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 顯色條件的選擇

2.1.1 最大吸收波長(zhǎng)的確定

茚三酮與甘氨酸顯色后溶液呈現(xiàn)紫色，其可見吸收光譜如圖1所示。最大吸收波長(zhǎng)在570 nm處，410 nm處雖也有強(qiáng)吸收峰，但因該吸收波長(zhǎng)選擇性不高，故不予以采用[3]。

圖1 可見吸收光譜曲線

2.1.2 反應(yīng)溫度的選擇

按1.2.1所述步驟，加入顯色劑茚三酮的濃度為0.6%(wt.%)，還原劑抗壞血酸的濃度為0.036%(wt.%)，分別將容量瓶置于30、50、60、75、90 ℃恒溫水浴槽中加熱10 min。考察顯色反應(yīng)溫度對(duì)吸光度的影響，結(jié)果如圖2所示。由圖2可見，隨著反應(yīng)溫度的升高，反應(yīng)溶液的吸光度也逐漸增大，在75℃達(dá)到最大。因此，選擇75℃為最佳顯色反應(yīng)溫度。

圖2 反應(yīng)溫度對(duì)吸光度的影響

2.1.3 反應(yīng)時(shí)間的選擇

按1.2.1所述步驟，加入顯色劑茚三酮的濃度為0.6%(wt.%)，還原劑抗壞血酸的濃度為0.036%(wt.%)，分別將容量瓶置于75℃的恒溫水浴槽中加熱5、8、10、12、15 min?？疾祜@色反應(yīng)時(shí)間對(duì)吸光度的影響，結(jié)果如圖3所示。由圖3可見，隨著水浴加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，反應(yīng)溶液的吸光度也逐漸增大，10 min達(dá)到最大后又開始下降。反應(yīng)達(dá)15 min時(shí)，溶液的最大吸收波長(zhǎng)發(fā)生藍(lán)移，從570 nm變?yōu)?67 nm（如圖4）。故最佳水浴時(shí)間確定為10 min。

圖3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)吸光度的影響

2.1.4 茚三酮用量的選擇

固定抗壞血酸的濃度為0.036%(wt.%)，顯色反應(yīng)溫度為75℃，反應(yīng)時(shí)間為10 min。考察顯色劑茚三酮濃度對(duì)吸光度的影響。由圖5可見，隨著茚三酮濃度的增加，溶液的吸光度也逐漸增加，濃度達(dá)到0.6%(wt.%)后上升趨勢(shì)變緩。因此，茚三酮的濃度確定為0.6%。

圖4 反應(yīng)15 min的吸收光譜曲線

圖5 茚三酮用量對(duì)吸光度的影響

2.1.5 抗壞血酸用量的選擇

茚三酮與α-氨基酸的顯色反應(yīng)有較多的副反應(yīng)。為了得到紫色的主反應(yīng)產(chǎn)物，需要加入一些還原劑抑制副反應(yīng)的發(fā)生。通常的還原劑有氰化鈉、氯化亞錫和三氯化鈦等，這些還原劑有一定的毒性或會(huì)對(duì)環(huán)境有不良影響。文獻(xiàn)[3]采用抗壞血酸作還原劑獲得了較好的顯色效果，因此本文也用抗壞血酸做還原劑。

固定茚三酮的濃度為0.6%(wt.%)，顯色反應(yīng)溫度為75℃，反應(yīng)時(shí)間為10 min?？疾炜箟难釢舛葘?duì)吸光度的影響。由圖6可見，隨著抗壞血酸濃度的增加，溶液的吸光度也逐漸增大，濃度到達(dá)0.036%(wt.%)后吸光度變化很小。故抗壞血酸的最佳濃度選定為0.036%。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

配制一系列不同濃度的甘氨酸溶液，在已確定的最佳實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)定其吸光度，獲得的工作曲線如圖7所示。吸光度與甘氨酸的濃度在0.75～3.75 μg/g呈線性關(guān)系，線性方程為A=0.148+0.071 7c（μg/g），相關(guān)系數(shù)R=0.994 2。

圖6 抗壞血酸用量對(duì)吸光度的影響

圖7 工作曲線

2.3 樣品的分析

2.3.1 游離甘氨酸與甘氨酸亞鐵的分離

茚三酮不但能與游離的甘氨酸發(fā)生反應(yīng)，而且可以和甘氨酸亞鐵中的甘氨酸反應(yīng)并促使甘氨酸亞鐵分解。因此，采用茚三酮作顯色劑測(cè)定甘氨酸亞鐵產(chǎn)品中的游離甘氨酸必須先把甘氨酸分離出來(lái)。從氨基酸螯合物產(chǎn)品中分離出游離氨基酸通常有凝膠過(guò)濾色譜法[4]和離子交換法[5]，然而這些方法操作繁瑣，實(shí)驗(yàn)條件控制要求高。本文利用甘氨酸和甘氨酸亞鐵在冰醋酸中溶解度的差異來(lái)實(shí)現(xiàn)兩者的分離。

作者測(cè)定了25℃時(shí)甘氨酸和甘氨酸亞鐵在醋酸中的溶解度。結(jié)果顯示，甘氨酸的溶解度為440 mg/100 ml醋酸，而甘氨酸亞鐵的溶解度小于2 mg/100 ml醋酸。由于兩者的溶解度差異很大，可以通過(guò)溶解過(guò)濾的簡(jiǎn)單辦法實(shí)現(xiàn)兩者的分離，具體過(guò)程參閱文獻(xiàn)[6]。

2.3.2 樣品的測(cè)試結(jié)果

按1.2.3所述步驟測(cè)定甘氨酸亞鐵產(chǎn)品中的游離甘氨酸含量，同時(shí)做加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，測(cè)定結(jié)果如表1所示。同一樣品6次測(cè)定的RSD為2.32%，表明方法的精密度較好。在樣品中加入0.5、1.0和2.0 mg/g的分析純甘氨酸，回收率為95.4%～106.9%，表明該方法的準(zhǔn)確度也較好。因此，該方法可以用于甘氨酸亞鐵產(chǎn)品中游離甘氨酸的測(cè)定。

3 小結(jié)

采用茚三酮分光光度法對(duì)甘氨酸亞鐵產(chǎn)品中游離甘氨酸含量進(jìn)行了測(cè)定。最佳顯色條件為：茚三酮的濃度為0.6%，抗壞血酸濃度為0.036%，顯色反應(yīng)溫度為75℃，顯色反應(yīng)時(shí)間為10 min。在最佳條件下，工作曲線的線性范圍為0.75～3.75 μg/g，相關(guān)系數(shù)R=0.994 2。實(shí)際樣品測(cè)定結(jié)果的RSD為2.32%，加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)的回收率為95.4%～106.9%。該方法具有較高精密度和準(zhǔn)確度，能夠滿足實(shí)際樣品分析檢測(cè)的要求。