張繼琛，婁 凱，閆李俠 (浙江省臺(tái)州市第一人民醫(yī)院，溫州醫(yī)學(xué)院附屬黃巖醫(yī)院，浙江 臺(tái)州 318020)

微小RNA(miRNA)是一種小的非編碼RNA，與靶mRNA的3'UTR完全或者不完全結(jié)合，降解靶mRNA或者抑制靶mRNA翻譯。miRNA與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、造血調(diào)控和脂肪代謝等過程密切相關(guān)。微小RNA(microRNA)是一類長(zhǎng)約22nt的非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)。大量實(shí)驗(yàn)表明miRNA參與了細(xì)胞增殖、分化和凋亡，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要的調(diào)控作用［1］。近來，microRNA－451(miR－451)在乳腺癌、卵巢癌及胃癌研究中均有報(bào)道［2－4］，但在肺癌方面報(bào)道較少，為探討miR－451在肺癌發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮的作用，筆者在體外驗(yàn)證miR－451在正常肺細(xì)胞株及肺癌細(xì)胞株的表達(dá)差異，通過臨床標(biāo)本檢測(cè)該小分子在正常肺臟組織、癌旁組織及肺細(xì)胞癌中的表達(dá)，為進(jìn)一步探討miR－541在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料:培養(yǎng)基高糖DMEM購自Hycolone公司，胎牛血清為美國(guó)Gibco公司生產(chǎn)。Bulge.100p1M miRNA定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引物試劑盒購于廣州銳博生物科技有限公司。Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司。Trizol試劑購自Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄(RT)試劑盒購自ToYoBo公司，PCR試劑盒購自Fermentas公司;其他試劑皆為分析純。CCK.8試劑盒購自蘇州碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染:NSCLC肺癌細(xì)胞株A549由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所提供。用含10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃，5%(體積分?jǐn)?shù))CO2:培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將細(xì)胞消化后種于96孔板，待細(xì)胞密度達(dá)到30% ～50%采用lipo－2000脂質(zhì)體將不同濃度(5 nmol/L、10 nmol/L、20 nmol/L)的miR－451模擬物及陰性對(duì)照轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，每組6孔，轉(zhuǎn)染后0、24 h、48 h、72 h分別采用 WST－8測(cè)定細(xì)胞存活率并繪制生長(zhǎng)曲線，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2 組織來源及患者特點(diǎn):共有組織35例，患者年齡45～75歲，所有病例組織來自于溫州醫(yī)學(xué)院附屬黃巖醫(yī)院胸外及呼吸內(nèi)科，標(biāo)本取自手術(shù)切除肺癌組織、肺癌周圍組織以及肺癌周圍正常肺組織。①肺癌組織:取自實(shí)性癌中未壞死的區(qū)域。②癌周組織:肺癌周圍2 cm以內(nèi)的未壞死組織。③正常肺組織:肺癌周圍3 cm以外的未壞死組織。所有患者術(shù)前未接受任何抗腫瘤藥物治療，未進(jìn)行介入治療。組織標(biāo)本離體后，立即放入液氮冷藏，－80℃保持備用。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miR－451表達(dá)水平:①總RNA的提取:收取細(xì)胞沉淀后直接用Trizol重懸，組織加入1 ml Trizol后用勻漿器研磨，加入200μl氯仿，劇烈震蕩15 s，室溫靜置10 min后，12 000 r/min，4℃離心15 min，吸取上層水相加入等體積預(yù)冷的異丙醇，置于－20℃冰箱30 min以上;再采用12 000 r/min，4℃ 離心 15 min，棄上清，75%乙醇(無 RNA 酶水配置)漂洗RNA沉淀，DEPC水溶解RNA沉淀。根據(jù)Bulge－LoopTMmiRNA定量PCR引物試劑盒說明書操作，取2μg總RNA，加入內(nèi)參U6及目的小分子RNA miR－451逆轉(zhuǎn)錄引物，70℃ 10 min，混合物取出后立即置冰上，冰育2 min，隨后加入逆轉(zhuǎn)錄其他試劑。RT反應(yīng)程序?yàn)?42℃ 60 min，70℃10 min。RT反應(yīng)結(jié)束后立即將cDNA產(chǎn)物取出，快速置冰上冷卻，置－80℃?zhèn)溆?。②?shí)時(shí)定量PCR:以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，在實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系:10μg 2×SYBR@Green Realtime PCR Master Mix(Toyobo)，10 μmol/L 5'及3'引物0.5 μl，1 μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，加滅菌雙蒸水至20μl。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性1 min，95℃ 15 s，60℃20 s，70℃ 10 s，共40個(gè)循環(huán)。溶解曲線反應(yīng)條件:95℃ 15 s，60℃ 15 s，95℃ 15 s。采用相對(duì)定量方法計(jì)算靶miRNA相對(duì)表達(dá)量，計(jì)算公式為:相對(duì)miRNA表達(dá)量=2－(⊿Ct樣品－⊿Ct對(duì)照)。Mir－451及其內(nèi)參U6的引物購于購于廣州銳博生物科技有限公司。③CCK－8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖:待測(cè)細(xì)胞96孔板每孔加入10μl CCK－8溶液。同時(shí)用加了相應(yīng)量細(xì)胞培養(yǎng)液和CCK－8溶液，但未加入細(xì)胞的孔作為空白對(duì)照。在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育0.5～4.0 h。采用酶標(biāo)儀在450 min波長(zhǎng)處測(cè)定A值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用t檢驗(yàn)，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR－451在正常胚肺細(xì)胞株及肺癌細(xì)胞株中的表達(dá):mir－541在肺癌細(xì)胞(A549)中的表達(dá)比正常肺細(xì)胞顯著降低(0.294±0.066、0.894±0.023)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 miR－451模擬物抑制腫瘤細(xì)胞的增殖:分別給予肺癌細(xì)胞株 A549不同濃度(5 nmol/L、10 nmol/L、20 nmol/L)的miR－145模擬物處理后，不同濃度均可使其增殖能力明顯減弱，5 nmol/L可出現(xiàn)抑制作用，10 nmol/L效應(yīng)明顯，但10 nmol/L同20 nmol/L效應(yīng)無顯著差異，故采用10 nmol/L濃度處理細(xì)胞后進(jìn)行不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖能力檢測(cè)。細(xì)胞增殖在24 h即出現(xiàn)明顯抑制，72 h仍有抑制效應(yīng)。

2.3 miR－145在正常組織、癌周組織、癌組織中的表達(dá):在癌組織中表達(dá)顯著低于正常組織與癌周組織(0.124±0.002、0.870±0.034、0.896±0.008)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，前者降低7倍(P＜0.05)，正常組織及癌周組織比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

3 討論

miRNA在細(xì)胞的增殖、分化等方面發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。多種miRNAs與腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程密切相關(guān)，miRNA通過調(diào)節(jié)其靶mRNA的表達(dá)發(fā)揮促進(jìn)或者抑制腫瘤進(jìn)展的作用。作為轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)的關(guān)鍵因子，該小分子的出現(xiàn)對(duì)腫瘤發(fā)生機(jī)制的闡明、腫瘤治療及預(yù)后均具有重要意義。miR－451為眾多小分子RNA中的一員，miR－451位于染色體17q 11.2，與原癌基因人類表皮生長(zhǎng)因子受體2的17q 11.2－21區(qū)域臨近［5－6］。然而，miR －451在腫瘤方面作用的研究尚處于初級(jí)階段。2005年Ahuvia等首次發(fā)現(xiàn)miR－451［7］。2009年Bandres等研究發(fā)現(xiàn)miR－451與預(yù)后不良相關(guān)［4］。與無瘤組織相比，原位雜交顯示胃癌和結(jié)腸癌上皮細(xì)胞miR－451表達(dá)降低。胃癌細(xì)胞AGS和結(jié)腸癌上皮細(xì)胞DLDI。miR－451過表達(dá)則降低細(xì)胞擴(kuò)增及增加放射敏感性。微陣列及生物信息學(xué)分析鑒別出新的致癌基因巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(MIF)是miR－451的潛在靶點(diǎn)，而MIF是參與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的重要因子［8－9］。2010年 Godlewski等研究 miR －451表達(dá)對(duì)腦膠質(zhì)瘤遷移的影響［10］。2007年Brueckner等研究發(fā)現(xiàn)miRNA－451在支氣管肺泡干細(xì)胞保持自我更新能力中發(fā)揮重要作用，深入研究發(fā)現(xiàn)miR－451通過影響細(xì)胞骨架而調(diào)控遷移［11］。在肺癌與miRNA研究中，2011年蘭海等研究在非小細(xì)胞肺癌中高表達(dá)的miR－21對(duì)腫瘤細(xì)胞的增值和凋亡有重要調(diào)節(jié)作用，抑制腫瘤抑制基因程序性細(xì)胞死亡因子4的表達(dá)［12］。Chen等研究將miR－145轉(zhuǎn)染至非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞后，癌細(xì)胞的原癌基因c－myc表達(dá)下調(diào)，增殖受到抑制［13］。

本研究結(jié)果表明，miR－451的低表達(dá)在肺細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮著重要作用，它可能作為肺細(xì)胞癌惡性行為的重要標(biāo)志，同時(shí)也為治療及預(yù)后提供一些理論基礎(chǔ)。

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