王春偉，高 璞，蘇澤智，李青旺，楊公社，胡建宏*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.白水縣動(dòng)物疫病控制預(yù)防中心,陜西 白水 715600)

1956年，Polge率先利用冷凍豬精液人工授精，并獲得仔豬，開啟了豬精液冷凍技術(shù)研究的序幕。雖然對(duì)豬精液冷凍的研究經(jīng)過了幾十年的發(fā)展，但迄今利用冷凍精液進(jìn)行人工授精的應(yīng)用不足1%，與牛冷凍精液的應(yīng)用相比仍然存在很大差距。其中的主要原因是豬精子對(duì)低溫非常敏感，且冷凍-解凍過程中精子的功能極易遭受機(jī)械性損傷以及溶液性損傷。此外，由于目前豬冷凍精液采用小劑量包裝，人工授精時(shí)一次輸精劑量不能滿足精子數(shù)量的要求，因而嚴(yán)重制約了冷凍精液的應(yīng)用與推廣。冷凍保護(hù)劑在精液冷凍保存過程中，對(duì)精子的冷凍效果至關(guān)重要。自從甘油用作精子冷凍保護(hù)劑后，家畜精液冷凍技術(shù)得到迅速發(fā)展。本文通過分析滲透性和非滲透性冷凍保護(hù)劑的作用機(jī)理及應(yīng)用情況，為豬精液的冷凍保存研究和應(yīng)用提供參考，以便促進(jìn)豬精液冷凍技術(shù)的發(fā)展。

1 滲透性冷凍保護(hù)劑的保護(hù)作用

滲透性冷凍保護(hù)劑大多是一些小分子物質(zhì)，能夠穿入細(xì)胞膜而滲透到細(xì)胞內(nèi)，降低溶液中電解質(zhì)的濃度，減輕冷凍-解凍過程中細(xì)胞滲透性腫脹，避免細(xì)胞脫水皺縮。滲透性冷凍保護(hù)劑主要有甘油、二甲基亞砜(DMSO)、丙二醇(PROH)、乙二醇(EG)、木糖醇、乙酰胺、阿東糖醇等。甘油是目前應(yīng)用最為廣泛的一種冷凍保護(hù)劑，對(duì)精子既有保護(hù)作用，又有毒害作用。甘油可以濃縮或結(jié)合細(xì)胞內(nèi)的水分，降低溶液中電解質(zhì)的濃度和滲透壓。開發(fā)新型冷凍保護(hù)劑替代或者部分替代甘油是當(dāng)前冷凍保護(hù)劑研究的趨勢(shì)。Bianchi等[1]研究了二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基乙酰胺(DMA)和甲基甲酰胺(NMF)等酰胺類物質(zhì)對(duì)豬精液冷凍保存效果，表明用50 mL/L的DMF代替甘油起到較好的效果；張樹山等[2]研究證實(shí)DMF與甘油混合使用比單一使用效果更好。

在精液的冷凍過程中，精子冷凍和解凍的關(guān)鍵階段是精子的初始冷卻以及恢復(fù)到正常生理環(huán)境的時(shí)期，實(shí)際上精液冷凍保存過程基本上是一個(gè)冷凍干燥過程。在冷卻過程中，精子脫水達(dá)到冰晶形成的溫度時(shí)，精子外環(huán)境隨著精子全部脫水而結(jié)晶化，而精子內(nèi)未形成冰晶，因此可保護(hù)精子內(nèi)物質(zhì)。美國科學(xué)家Mazur[3]提出兩因素理論來解釋造成細(xì)胞或胚胎低溫?fù)p傷的原因。溶液損傷是由于冷卻速率過慢，大量水分在胞外的溶液中結(jié)冰，使得溶液濃度提高，造成胞內(nèi)水分大量滲出，從而導(dǎo)致細(xì)胞強(qiáng)烈收縮，因?yàn)榧?xì)胞長時(shí)間處于高濃度的溶液中，致使細(xì)胞損傷；胞內(nèi)冰損傷是因?yàn)槔鋮s速率過快，胞內(nèi)水分不能及時(shí)通過細(xì)胞膜向外滲出，胞內(nèi)溶液由于過冷而結(jié)冰，造成細(xì)胞機(jī)械損傷。稀釋液中加入冷凍保護(hù)劑后，冷凍保護(hù)劑與水分子相結(jié)合，弱化了水的結(jié)晶過程，減少胞內(nèi)冰晶的形成。另外，冷凍保護(hù)劑能夠在精子內(nèi)外維持一定濃度，降低未結(jié)冰溶液電解質(zhì)的濃度，從而使精子免受損傷。

2 非滲透性冷凍保護(hù)劑的保護(hù)作用

非滲透性冷凍保護(hù)劑一般是些大分子物質(zhì)，用于生產(chǎn)中的非滲透性冷凍保存劑以單糖、雙糖較常見。非滲透性保護(hù)劑不能滲入到細(xì)胞內(nèi)，在冷凍過程中能夠提高細(xì)胞外滲透壓，使細(xì)胞內(nèi)的水分向細(xì)胞外滲出，引起細(xì)胞脫水、皺縮，減少胞內(nèi)冰晶形成，從而保護(hù)細(xì)胞免受破壞[4]。現(xiàn)今常用的非滲透性保護(hù)劑主要有海藻糖、蔗糖、聚蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、葡聚糖、聚已二醇(PEG)以及白蛋白等。對(duì)于非滲透性冷凍保護(hù)劑的雙糖、海藻糖引起了研究人員的高度關(guān)注。海藻糖是一種十分穩(wěn)定的非還原性雙糖，與蔗糖和麥芽糖等具有相似的分子結(jié)構(gòu)和生理作用，是天然雙糖中最穩(wěn)定的糖類，對(duì)細(xì)胞無毒害作用。海藻糖具有獨(dú)特的非特異性保護(hù)作用，可以保護(hù)細(xì)胞磷脂的雙分子層，在冷凍過程中能夠在細(xì)胞膜外產(chǎn)生一種玻璃狀的保護(hù)層，提高細(xì)胞對(duì)胞外高滲溶液的耐受性，從而發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞活性的作用[5]。Garcia等[6]研究表明，海藻糖作為一種水分子替代分子，在冷凍過程中可使細(xì)胞膜在固相-液相相互轉(zhuǎn)變中免受損傷，在細(xì)胞內(nèi)主要作為一種親和性溶質(zhì)來對(duì)抗細(xì)胞膜外的滲透壓變化。海藻糖保護(hù)精子的機(jī)制與其晶體結(jié)構(gòu)、溶液的物理構(gòu)象和化學(xué)特性密切相關(guān)，冷凍時(shí)海藻糖可以強(qiáng)有力地束縛水分子，與膜脂質(zhì)共同擁有結(jié)合水或者本身起到代替膜結(jié)合水的功能，具有穩(wěn)定細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的特性，防止細(xì)胞因失水而造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能損傷。Jelinkova等[7]研究表明，海藻糖在動(dòng)物精液冷凍保存中的作用類似于其他雙糖，尤其是蔗糖，但一定要與滲透性冷凍保護(hù)劑結(jié)合使用才能更加有效地保護(hù)精子。Alex等[8]研究表明，通過向豬精液冷凍稀釋液中添加海藻糖后，能夠有效提高精子的活力、質(zhì)膜完整性以及頂體完整率。近年來，科學(xué)家致力于非滲透性冷凍保護(hù)劑的研究，并結(jié)合向稀釋液中添加其他成分以改善凍后精子質(zhì)量。張婷等[9]研究證實(shí)，海帶多糖可以提高凍后精子活率、頂體完整率、質(zhì)膜完整率和DNA完整率，同時(shí)清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化和提高抗氧化酶活性。張樹山等[10]研究表明，稀釋液中添加濃度為6 mg/L的紅景天多糖較能明顯提高豬冷凍精子品質(zhì)，并能為豬精子提供較好的抗氧化作用。Hu[11]等研究發(fā)現(xiàn)，絞股藍(lán)多糖對(duì)豬精液的冷凍保存具有一定保護(hù)作用。

3 其他保護(hù)劑對(duì)豬精子的保護(hù)作用

經(jīng)多年研究，豬精液冷凍稀釋液的基本成分已經(jīng)確定，研究者們嘗試在已有的稀釋液中加入一些其他成分，用來改善精子外環(huán)境的理化性質(zhì)，提高精子活力和受精能力。李青旺等[12]研究表明，豬冷凍稀釋液中添加安鈉咖后精子的凍后活力可提高到57%。曾維斌等[13]在豬冷凍稀釋液中添加2 mg/mL咖啡因，凍后精子活力以及存活時(shí)間明顯改善。張樹山等[14]研究表明，大豆卵磷脂可以在豬精液冷凍保存中起到一定的抗凍保護(hù)作用。Hu等[15]研究表明，豬精液冷凍稀釋液中添加9%(v/v)的低密度脂蛋白(LDL)，凍后精子活率和頂體完整率顯著提高；Jiang等[16]研究表明，添加8%～9%的LDL能較好保護(hù)凍后豬精子的DNA完整性。李博玲等[17]報(bào)道單獨(dú)添加0.25 mg/mL褪黑素、5 mmol/L谷胱甘肽以及聯(lián)合添加0.125 mg/mL褪黑素和1 mmol/L谷胱甘肽，均能減少精液冷凍過程中活性氧的生成，顯著提高冷凍精子解凍后的質(zhì)量。楊寶衛(wèi)等[18]研究表明，鹽酸多巴胺能有效改善凍后豬精子的畸形率和頂體完整率。李美珍等[19]將中藥提取物冷凍豬精液，表明鹽酸川穹嗪均能顯著降低凍后精子的畸形率，提高凍后精子的頂體完整率。研究還發(fā)現(xiàn)，生物類黃酮和多不飽和脂肪酸對(duì)豬精液冷凍保存具有一定保護(hù)作用。

4 存在的主要問題

豬精液中含有大量精清，精清中存在許多未被人類認(rèn)知的蛋白質(zhì)成分，對(duì)精子有一定的毒害作用[20]。在豬冷凍精液過程中通過離心去除精清，尚無法徹底消除精清對(duì)精子的影響。豬精子對(duì)低溫打擊非常敏感，在添加冷凍保護(hù)劑的情況下，如果能以5000 ℃/s的速度降溫，使精子快速越過0～-60 ℃的危險(xiǎn)溫區(qū)，則可改善冰晶對(duì)精子的損傷。由于豬冷凍精液生產(chǎn)過程復(fù)雜，精子可能長時(shí)間暴露在有氧環(huán)境下使大量精子膜損傷，呼吸抑制，需要有效的抗氧化劑減少精子自身過氧化損傷。雖然對(duì)精子凍傷的研究已經(jīng)發(fā)展到分子水平，但仍然需要結(jié)合各種研究手段探索提高精子凍后活力的方法。

目前，豬冷凍精液在人工授精生產(chǎn)中的應(yīng)用量很少。豬冷凍精液細(xì)管的生產(chǎn)過程較為復(fù)雜，冷凍稀釋液配方成分尚不確定，大劑量包裝的豬冷凍精液尚在試驗(yàn)階段，難以用于生產(chǎn)和應(yīng)用。因此，豬冷凍精液難以達(dá)到人工授精的基本要求，從而嚴(yán)重制約了豬冷凍精液在豬育種及其商品化生產(chǎn)中的推廣與應(yīng)用。

5 豬冷凍精液應(yīng)用前景

精液冷凍保存技術(shù)可以建立一個(gè)不受時(shí)間、地域限制的“精子庫”，為大量母豬提供攜帶優(yōu)秀基因的精子，加快品種培育遺傳進(jìn)展和改良速度，還為豬繁殖生產(chǎn)提供生物安全保障，避免種畜間的疾病傳播，并使得原有90%～95%的種公豬可被淘汰，大大節(jié)省飼養(yǎng)成本。同時(shí)精液冷凍保存技術(shù)也為瀕危品種遺傳資源基因庫的建立開辟了一條高效低成本的保存與利用途徑。豬精液冷凍保存最主要的目的就是滿足人工授精的需求。在當(dāng)前冷凍保護(hù)劑應(yīng)用的基礎(chǔ)上，研究冷凍保護(hù)劑之間的配伍效應(yīng)，尋找新型的冷凍保護(hù)劑代替或者部分代替對(duì)精子有毒害作用的保護(hù)劑是今后研究的趨勢(shì)。目前對(duì)精液冷凍保護(hù)的研究主要工作仍停留在保護(hù)劑的開發(fā)和冷凍過程的完善，而分析保護(hù)劑對(duì)豬精液的毒害作用，精子中各種蛋白在冷凍前后表達(dá)差異，豬精液凍融后超微結(jié)構(gòu)的變化，精子抗凍能力和冷凍對(duì)精子有關(guān)基因和人工授精的后代的影響研究較少，下一步研究應(yīng)該探究冷凍在分子層面上對(duì)精子的損傷機(jī)理。

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