■郭曉明 陸圣杰 王佳亮 許甲平朱 賢 鄧志剛

（1.上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，上海 201418;2.上海德邦牧業(yè)有限公司，上海 201108）

相對(duì)于無(wú)機(jī)鹽形式的微量元素而言，氨基酸螯合物可以大幅度提高動(dòng)物對(duì)微量元素的吸收利用率，同時(shí)具有殺菌、促酶活等功能，因此，近年來(lái)已經(jīng)成為飼料添加劑的重要組成部分[1]。甘氨酸亞鐵能夠提高動(dòng)物體內(nèi)的血紅素含量和轉(zhuǎn)鐵蛋白的含量，對(duì)動(dòng)物的缺鐵性貧血具有很好的預(yù)防和治療作用。近期的研究還表明，甘氨酸亞鐵能顯著改善仔豬的生長(zhǎng)性能[2]，提高蛋雞的產(chǎn)蛋率和改善蛋品質(zhì)[3]。因此，在眾多的氨基酸微量元素螯合物中，甘氨酸亞鐵的研究和使用最為廣泛。

甘氨酸亞鐵產(chǎn)品中游離甘氨酸（未螯合的甘氨酸）的含量能體現(xiàn)生產(chǎn)過(guò)程中甘氨酸與亞鐵離子的螯合率，在一定的前提條件下也能反映甘氨酸亞鐵的穩(wěn)定性，是評(píng)價(jià)生產(chǎn)工藝和產(chǎn)品性能的一項(xiàng)重要指標(biāo)。當(dāng)前國(guó)標(biāo)(GB/T 21996—2008)有關(guān)甘氨酸亞鐵產(chǎn)品中游離甘氨酸的測(cè)定采用非水滴定法。然而，化驗(yàn)人員普遍反映在測(cè)試過(guò)程中存在滴定終點(diǎn)快速返色導(dǎo)致無(wú)法準(zhǔn)確判斷終點(diǎn)的問(wèn)題。

本文簡(jiǎn)單介紹了非水滴定原理，分析了國(guó)標(biāo)(GB/T 21996—2008)所制定方法中存在的問(wèn)題，在此基礎(chǔ)上，提出了可行的改進(jìn)方法，并用實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了驗(yàn)證。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及試劑

循環(huán)水式真空泵（河南鞏義予華儀器廠），恒溫水浴槽（HHS-21，上海博迅醫(yī)療設(shè)備有限公司），電子天平（BS224S，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），量程為50 ml的酸式滴定管和量程為5 ml的微量滴定管（上海申玻儀器公司）。高氯酸、冰醋酸、醋酸酐、鄰苯二甲酸氫鉀、甘氨酸均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司，高氯酸是濃度為70%的水溶液，其它試劑為分析純；結(jié)晶紫指示劑按照國(guó)標(biāo)GB/T 603的方法配制，濃度為0.5 g/l，甘氨酸亞鐵（甘氨酸與亞鐵離子的摩爾比為1∶1）由作者實(shí)驗(yàn)室自行制備。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 高氯酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制與標(biāo)定

1.2.1.1 溶液的配制

量取0.7～0.9 ml濃度為70%的高氯酸與500 ml冰醋酸混合均勻，加入30 ml醋酸酐搖振，使其充分混合，再用冰醋酸稀釋至1 000 ml。靜置過(guò)夜，使醋酸酐與水充分反應(yīng)，此溶液貯藏于棕色瓶中，臨用前標(biāo)定。

1.2.1.2 溶液的標(biāo)定

精確稱取鄰苯二甲酸氫鉀（110℃恒重）約0.5 g，溶于50 ml冰醋酸中，加入結(jié)晶紫指示劑4～5滴，用高氯酸的冰醋酸溶液滴定至藍(lán)綠色。

1.2.2 甘氨酸與甘氨酸亞鐵在冰醋酸中的溶解度測(cè)定

在燒杯中加入100 ml冰醋酸并置于溫度為25℃的恒溫水浴槽中。稱取一定質(zhì)量的甘氨酸于稱量瓶中，分多次從中移取適量甘氨酸至冰醋酸中，攪拌，直至有不溶物出現(xiàn)為止，稱量剩余甘氨酸質(zhì)量，用減量法求出冰醋酸中已溶解的甘氨酸質(zhì)量。計(jì)算出25℃下，甘氨酸在冰醋酸中的溶解度。采用相同的方法測(cè)定甘氨酸亞鐵在冰醋酸中的溶解度。

1.2.3 甘氨酸亞鐵中游離甘氨酸的分離

稱取0.5 g甘氨酸亞鐵樣品溶于一定量的冰醋酸中，攪拌5 min，再浸漬10 min，減壓過(guò)濾，用少量冰醋酸洗滌濾餅，濾液用于滴定分析。

1.2.4 游離甘氨酸的測(cè)定

1.2.4.1 未預(yù)先分離游離甘氨酸（國(guó)標(biāo)GB/T 21996—2008的方法）：稱取0.5 g甘氨酸亞鐵（精準(zhǔn)至0.000 2 g），置于250 ml錐形瓶中，加入30 ml冰醋酸，攪拌5 min，再浸漬10 min，加入4～5滴結(jié)晶紫指示劑，溶液此時(shí)顯紫紅色。用高氯酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，溶液由紫紅色變?yōu)樗{(lán)綠色為滴定終點(diǎn)。同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)。

1.2.4.2 預(yù)先分離游離甘氨酸：先按1.2.3所述方法分離甘氨酸亞鐵樣品中的游離甘氨酸，在濾液中加入指示劑，用高氯酸滴定。

2 結(jié)果與討論

2.1 非水滴定法測(cè)定氨基酸簡(jiǎn)介（以甘氨酸為例）

氨基酸分子中含有-NH2和-COOH，為一兩性物質(zhì)。在水中，甘氨酸的酸性(羧基上的氫Ka=2.5×10-10)和堿性(氨基作為堿的Kb=2.2×10-12)都很弱，無(wú)法用酸堿滴定法準(zhǔn)確滴定[4]。根據(jù)酸堿理論中的區(qū)分效應(yīng)原理，甘氨酸在非水介質(zhì)冰醋酸中相當(dāng)于一種強(qiáng)堿，用HClO4(在冰醋酸中也顯強(qiáng)酸性)作滴定劑，可實(shí)現(xiàn)甘氨酸的準(zhǔn)確滴定。該方法屬于酸堿滴定范疇，滴定反應(yīng)式如下：

滴定采用結(jié)晶紫作指示劑，當(dāng)pH值大于3.0時(shí)指示劑顯紫色，當(dāng)pH值小于等于2.0時(shí)顯藍(lán)綠色。高氯酸滴定冰醋酸中的甘氨酸時(shí)，滴定終點(diǎn)的顏色由紫紅色變?yōu)樗{(lán)綠色。

2.2 國(guó)標(biāo)法測(cè)定游離甘氨酸過(guò)程中指示劑返色的原因

作者按國(guó)標(biāo)GB/T 21996—2008的方法對(duì)甘氨酸亞鐵中的游離甘氨酸進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，滴定終點(diǎn)極易發(fā)生返色現(xiàn)象（約1～2 s即返色，隨著滴定繼續(xù)進(jìn)行返色時(shí)間逐步延長(zhǎng)），導(dǎo)致難以判斷滴定終點(diǎn)。同時(shí)，作者發(fā)現(xiàn)滴定過(guò)程中的滴定速度、錐形瓶的搖蕩幅度和搖蕩頻率也對(duì)指示劑變色點(diǎn)的出現(xiàn)有很大影響。這與眾多生產(chǎn)和使用甘氨酸亞鐵的實(shí)驗(yàn)室化驗(yàn)人員反映的情況一致。

就固體狀態(tài)的甘氨酸亞鐵產(chǎn)品而言，游離甘氨酸即未與金屬離子發(fā)生螯合的那部分甘氨酸，這是控制生產(chǎn)工藝和評(píng)價(jià)產(chǎn)品性能的重要指標(biāo)，也是檢測(cè)的目標(biāo)物。然而，當(dāng)把甘氨酸亞鐵產(chǎn)品加入到冰醋酸中時(shí)，甘氨酸亞鐵存在解離平衡，如反應(yīng)②所示：

此時(shí)，游離甘氨酸包括兩部分，一是產(chǎn)品中未發(fā)生螯合反應(yīng)的甘氨酸，二是在醋酸中解離出來(lái)的甘氨酸。當(dāng)?shù)稳敫呗人釙r(shí)，兩部分游離甘氨酸都與高氯酸結(jié)合生成高氯酸鹽（如反應(yīng)①所示），過(guò)量的高氯酸使結(jié)晶紫由紫紅色變?yōu)樗{(lán)綠色。但是，滴定過(guò)程中甘氨酸濃度的降低打破了反應(yīng)②的平衡，甘氨酸亞鐵會(huì)進(jìn)一步解離產(chǎn)生游離甘氨酸，即反應(yīng)②的平衡向右移動(dòng)。平衡移動(dòng)產(chǎn)生的游離甘氨酸又與高氯酸結(jié)合，導(dǎo)致指示劑重新由藍(lán)綠色變?yōu)樽霞t色，即滴定終點(diǎn)返色。由于在滴定過(guò)程中反應(yīng)②的平衡移動(dòng)速度較快，在滴定速度較慢的情況下，滴定終點(diǎn)嚴(yán)重滯后。此時(shí)，高氯酸不僅滴定了產(chǎn)品中未發(fā)生螯合反應(yīng)的甘氨酸，也滴定了已發(fā)生螯合的部分甘氨酸。

由以上分析可知，采用非水滴定方法測(cè)定甘氨酸亞鐵產(chǎn)品中的游離甘氨酸時(shí)，應(yīng)先將游離甘氨酸從產(chǎn)品中分離出來(lái)。

2.3 甘氨酸亞鐵和游離甘氨酸的分離

從氨基酸螯合物產(chǎn)品中分離出游離氨基酸通常有凝膠過(guò)濾色譜法[5]和離子交換法[6]。這些方法操作繁瑣，條件控制要求高，且后續(xù)的檢測(cè)通常需要大型儀器。本文利用甘氨酸和甘氨酸亞鐵的溶解度的差異來(lái)實(shí)現(xiàn)兩者的分離。

由于甘氨酸亞鐵和甘氨酸均易溶于水[7]，且后續(xù)滴定是非水環(huán)境，因此首先排除水作分離溶劑的可能。甘氨酸亞鐵和甘氨酸在甲醇、乙醇中的溶解度均很小[8]，因此也不可采用醇類(lèi)作分離溶劑。按照1.2.2的步驟，作者測(cè)定了25℃時(shí)甘氨酸和甘氨酸亞鐵在醋酸中的溶解度。結(jié)果顯示，甘氨酸的溶解度為440 mg/100 ml醋酸，而甘氨酸亞鐵的溶解度小于2 mg/100 ml醋酸。由于兩者的溶解度差異很大，可以通過(guò)溶解過(guò)濾的簡(jiǎn)單辦法實(shí)現(xiàn)兩者的分離，具體過(guò)程如1.2.3所述。作者認(rèn)為，甘氨酸之所以在醋酸中有較大的溶解度是因?yàn)楦拾彼岬聂然桶被膳c醋酸分子之間形成氫鍵，而甘氨酸亞鐵中相應(yīng)的基團(tuán)已和亞鐵離子發(fā)生了配位，消弱了和醋酸形成氫鍵的能力。

2.4 樣品分析

采用冰醋酸作溶劑分離游離甘氨酸與甘氨酸亞鐵，然后滴定溶解于冰醋酸中的甘氨酸，結(jié)果如表1所示。滴定終點(diǎn)沒(méi)有返色現(xiàn)象，且滴定過(guò)程中滴定速度對(duì)滴定終點(diǎn)沒(méi)有影響。測(cè)試結(jié)果的RSD為3.7%，表明該方法的測(cè)試精密度較好。在甘氨酸亞鐵產(chǎn)品中加入1.00、1.50和5.00 mg/g的分析純甘氨酸按此改進(jìn)后的方法進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，回收率為95.4%～102.8%(見(jiàn)表2)，表明該方法的準(zhǔn)確度也較好。該方法能夠滿足實(shí)際樣品分析檢測(cè)的要求。

表1 甘氨酸亞鐵產(chǎn)品中游離甘氨酸的測(cè)試結(jié)果

表2 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表1還給出了未預(yù)先分離情況下樣品的測(cè)試數(shù)據(jù)（滴定速度為每秒1～2滴，指示劑30 s內(nèi)不返色為終點(diǎn)），游離甘氨酸的平均值為4.55 mg/g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為10.1%。與預(yù)先分離測(cè)試結(jié)果相比，游離甘氨酸的測(cè)定值顯著偏大。這是因?yàn)樵谖搭A(yù)先分離游離甘氨酸的情況下，高氯酸不僅滴定了產(chǎn)品中未發(fā)生螯合反應(yīng)的甘氨酸，也滴定了已發(fā)生螯合的部分甘氨酸，造成了很大的系統(tǒng)正誤差。測(cè)試結(jié)果的精密度下降則是由于滴定終點(diǎn)存在返色現(xiàn)象使終點(diǎn)的判斷不精確所致。顯然，不預(yù)先分離甘氨酸亞鐵中的游離甘氨酸直接進(jìn)行非水滴定的測(cè)試方法無(wú)法達(dá)到檢測(cè)目的，不能滿足分析檢測(cè)要求。

3 小結(jié)

采用非水滴定方法測(cè)定甘氨酸亞鐵產(chǎn)品中游離甘氨酸的含量，必須先把游離甘氨酸與甘氨酸亞鐵分離。否則，測(cè)試結(jié)果存在很大的系統(tǒng)正誤差且精密度低，不能滿足分析檢測(cè)要求。利用游離甘氨酸和甘氨酸亞鐵在冰醋酸中的溶解度差異可以實(shí)現(xiàn)兩者的分離。采用非水滴定方法對(duì)預(yù)分離后的游離氨基酸進(jìn)行了測(cè)定，RSD為3.7%，表明測(cè)試精密度較高；對(duì)甘氨酸亞鐵產(chǎn)品進(jìn)行了加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，回收率為95.4%～102.8%，表明該方法的準(zhǔn)確度良好。改進(jìn)后的方法能夠滿足實(shí)際樣品分析檢測(cè)的要求，且有望用于其它氨基酸螯合物中游離氨基酸的測(cè)定。